显微化学方法

植物解剖学中，利用新鲜材料与染色或化学反应方法柜结合，一方面用来确定梢物细胞壁或内含物的化学性质，另一方面用来分辨细胞的结构。显微化学试验可先用徒手切片法将材料切成薄片，一般应稍厚，大约在 20-40µm 之间，如杲太薄，有时因为所要观察的内容物太少，反而不易清楚地显示结果。

1 显示纤维素的化学方法：植物细胞的细胞壁最主要的成分是纤维素。纤维素在碘和硫酸的作用下变成蓝色。在细胞中，纤维素的成分越多，蓝色越明显，而强烈木质化的细胞壁，对纤维素虽然仍能发生上述反应，但因它被木质掩盖，因此不能作用，而小变蓝色。

方法是用 1%碘液（配制方法：先将 1.5g 碘化钾溶于 100mL 蒸馏水中，待全溶解后，加入 1g 碘，震荡溶解）滴在材料上，然后再加一滴 66.5%硫酸 (7 份浓硫酸 +3 份蒸馏水），经过这样处理，纤维素的细胞壁呈蓝色反应。

2 显示木质素的间苯三酚反应：间苯三酚反应是植物显微化学中检验木质化最常用和最简单的方法。切片先用一滴盐酸浸透（因间苯三酚在酸性环境下才能与木质起作用），然后滴一滴间苯三酚的乙醇溶液，木质化细胞壁可现出樱桃红或紫红色，其颜色深度取决于细胞壁木质化的程度。此染色法不适于作永久切片，因颜色会慢慢退去而变成淡黄色。

3 显示栓质和角质的化学方法：栓质和角质均为饱和与不饱和脂肪酸的衍生物，与苏丹Ⅲ作用呈现橘红色反应。

4 显示果胶质的化学方法：果胶质在植物细胞中分布很广泛，细胞壁胞间层部分甚至全部由果胶质所构成。检测植物细胞中的果胶质常采用钌红染色法：切片用 0.02%的钌水溶液染色 30 min, 细胞壁中的果胶成分被染成红色。另外亦可采用番红染色法：配0.5%-1.0%番红水溶液，可将果胶质细胞壁染成橙黄色（木栓质与木质素染成樱红色），此染液的缺点是不稳定，易褪色，如将切片用凡士林或石蜡在盖玻片周围封闭，置丁 2%绷酸中则能保色几个月。

5 显示淀粉粒的碘－碘化钾反应：淀粉是植物细胞中主要的储藏物质，它们在各种不同的植物细胞中形成各种不同形状的颗粒。由于碟与淀粉作用形成碘化淀粉呈蓝色反应，因此用碘液测试淀粉已成为最常用的方法。

6 显示多糖的高碘酸－希夫反应 (PAS 反应）：利用高碘酸（氧化剂）破坏多糖分子中的 C-C 键，变为醛基，碘基与希夫试剂（无色亚硫酸复红）柜结合，生成红色的反应产物。这一过程称为 PAS 反应。

试剂配制

(1)0.5%-0.8%高碘酸水溶液。

(2) 希夫试剂：将 1g 碱性品红溶于 200mL 煮沸的蒸馏水中，摇动 5-10 min, 冷却到50℃ 时过滤。向滤液中加入 1mol/L 盐酸 20mL, 冷却至 25℃, 加 2g 偏亚硫酸钾（或钠盐），摇匀，静置暗处过夜。加活性炭 2g, 摇动 2-3min, 用滤纸将溶液过滤于棕色细口瓶中。滤液应该是无色或淡黄色，若呈红色则不能使用。将合格的染液置于黑暗低温 (0-4℃) 下储存备用，用前将染液升到室温。若使偏业硫酸钾 2-3 倍于碱性品红，可增强希夫试剂活力。在提高偏亚硫酸钾用量的情况下，可使碱性品红变成无色，不用活性炭去色过滤。

(3) 洗涤液：偏亚硫酸钾（或钠）溶液

10%偏亚硫酸钾 5ml,

1mol/L HCI 5mL

蒸馏水 90mL

临用时将二者混合，使用新鲜混合液。

制片程序

(1)切片脱蜡至蒸馏水； (2) 流水冲洗 15-30 min; (3)0.5%-0.8%高碘酸溶液处理10 min; (4) 流水洗涤 5-10min, 蒸馏水过滤； (5) 移入希夫试剂中 20-30min; (6)用偏业硫酸钾溶液洗 3 次，每次 2-3 min;(7)流水洗涤 10-15 min, 并通过蒸馏水 5 min;(S)按常规通过各级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

7 显示蛋白质的汞-溴酚蓝法：蛋白质是构成原生质休的主要成分，也可成为后含物储藏在细胞内，成为无定形的结晶体或糊粉粒。目前测定糊粉粒最普通的方法是氯化汞-溴酚蓝法（试剂配制： 10g 氯化汞 (HgCI2),0.001g 溴酚蓝溶于 100mL 蒸馏水中］。将切片滴上此液一滴，染色 5min 后用 0.5%醋酸冲洗，除去切片上多余的染料，再放在培养皿中水洗 5 min, 用甘油封藏观察。细胞中有糊粉粒则被染成鲜蓝色。

8 显示油、脂肪、挥发油的化学力法：植物解剖中，染脂肪性物质最常用的是苏丹 III溶液，它有两个浓度不同的配方：

A 苏丹 Ill( 或苏丹Ⅳ) 0.1g

95% 乙醇 10mL

甘油 10mL

B 苏丹 Ill( 或苏丹Ⅳ) 0.0lg

95% 乙醇 5mL

甘油 5mL

切片放在上述任一种溶液中染色 24h, 然后用 50%乙醇洗涤，放人甘油中观察，油脂可染成淡黄色或红色，同时为了加速染色，可以微微加热

9 显示单宁的亚硫酸铁反应：单宁是一类酚类化合物的衍生物。许多植物细胞中都含有单宁，它存在于细胞质、液泡或细胞壁中。单宁被认为具有保护植物，抗水解、抗腐烂和动物危害的作用将新鲜组织切片投入 0.5%-1.0%的亚硫酸铁或氯化铁溶液（用 0.1mol/L HCI 配制）中染色后，可作暂时性封片进行观察；也可经乙醇脱水，二甲苯透明，制成永久制片。染色结果：若出现蓝色沉淀物则表明有单宁存在。

10 显示 DNA 的孚尔根反应：利用切片经 1mol/L HCl 60℃水解处理后， DNA 的脱氧戊糖间的醛基成为自由状态。希夫试剂同暴露出来的醛基发生反应，将核的染色质染成深紫红色。

试剂配制：

(1)1mol/L HCl 。

(2)希夫试剂配法见“多糖的高碘酸－希夫反应”。

(3)偏亚硫酸钠水溶液（洗涤液）配方见“多糖的高碘酸－希夫反应”。

制片程序

(1)组织经卡诺固定液固定4-8h, 固定时间不宜太长，太长会水解 DNA,减弱染色强度。

(2) 切片脱蜡并逐步过渡到蒸馏水。

(3) 在冷 1mol/L HCl 中 1-2min 。

(4)60℃热 1mol/L HCl 处理 15 min。

(5) 用冷 1mol/L HCl 略洗。

(6) 蒸馏水漂洗。

(7)希夫试剂反应 1-2h( 暗处）。

(8) 用偏亚硫酸钠水溶液洗 3 次，每次 3-5mm 。

(9) 流水冲洗 15-30min 。

(10) 蒸馏水漂洗。

(11)各级乙醇脱水，每级 10-15 min。至 95% 乙醇时，可用 0.1%亮绿（或固绿）的 95%乙醇溶液复染 15-60s 。

(12) 二甲苯透明，树胶封片。