牙髓干细胞DPSCs/乳牙干细胞SHED的原代培养

(a)用手术刀片将牙髓组织切成小碎片。

(b)将剪碎的组织放入胶原酶/中性蛋白酶混合溶液中（1:1)。

(c)37℃孵育30〜60min，间歇地摇匀组织/消化酶混合物。

(d)消化后，加人足够的MSC培养基，终止酶的活性。

(e)将悬液经70μm细胞滤膜过滤，去除细胞碎片，得到单细胞悬液。

(f)500g离心6min。

(g)倒掉上清液，用MSC培养基重悬细胞。然后进行免疫磁珠分选:和能与DPSC细胞反应的一抗孵育，包括STRO-I(小鼠抗人MSC;IgM),CC9(小鼠抗人CD146/MUC-18;IgG2a)，或3G5(小鼠抗人外膜细胞；IgM)，20Mg/mL,冰上孵育lh。用含1%BSA的PBSA洗两遍，600g离心6min。羊抗小鼠IgG或大鼠抗小鼠IgM结合磁珠的任意一个二抗孵育，4℃回转式混合仪40min。根据产品说明书推荐的方案，通过DyndMPC®-1磁分离器分离结合磁珠的细胞。

(h)细胞计数，按（1〜10)×10³个细胞/cm²密度接种到培养瓶或皿上。

(i)在MSC培养基、37℃和5%CO₂的培养箱中培养。

(j)细胞分离后7天，用PBSA洗培养瓶，更换培养基。之后可以一周两次更换培养基，直至细胞达到汇合。