疏水作用层析在蛋白质纯化中的理论及应用实验

H I C 吸附剂的使用方法

1. 介绍

H IC 吸 附 剂 可 直 接 用 于 对 蛋 白 质 复 合 物 的 纯 化 。其 纯 化 程 序 由 如 下 一 系 列 步 骤 组成 ，本 部 分 将 比 较 详 细 地 介 绍 该 内 容 。

2. 吸附剂的选择

某 一 给 定 蛋 白 质 的 疏 水 性 通 常 是 未 知 的 ，所 以 在 选 择 最 终 的 吸 附 剂 前 ，需 要 进 行 若 干个 吸 附 剂 的 筛 选 。筛 选 过 程 就 是 为 了 测 定 该 吸 附 剂 与 蛋 白 质 的 结 合 强 度 ，决 定 有 哪 些 候选 的 吸 附 剂 可 用 于 蛋 白 质 的 纯 化 。吸 附 剂 疏 水 性 的 初 步 筛 选 用 于 决 定 复 合 物 的 疏 水 性 以及 何 种 吸 附 剂 可 以 有 效 纯 化 蛋 白 质 ，筛 选 应 该 包 括 较 广 范 围 的 疏 水 性 结 合 特 性 的 吸 附 剂 。
吸 附 剂 可 以 以 预 装 柱 的 形 式 从 吸 附 剂 供 应 商 处 购 买 ，或 需 要 使 用 者 自 行 填 装 。在 需要 填 装 层 析 柱 的 情 况 下 ，应 参 考 供 应 商 的 填 装 说 明 。可 采 用 与 理 论 塔 板 髙 度 相 当 的 尺 寸来 验 证 层 析 柱 是 否 正 确 填 装 。一 旦 填 装 好 ，吸 附 剂 供 应 商 通 常 会 提 供 一 些 操 作 使 用 范 围的 建 议 ，包 括 允 许 的 流 速 范 围 、层 析 操 作 的 条 件 和 层 析 柱 清 洁 方 法 等 。不 同 的 吸 附 剂 ，可接 受 的 操 作 条 件 是 不 同 的 ，在 使 用 之 前 应 仔 细 阅 读 产 品 的 销 售 文 件 。

3. 原料/样品的准备

在 样 品 上 样 于 层 析 柱 之 前 ，必 须 采 用 高 浓 度 盐 的 缓 冲 液 提 髙 蛋 白 质 混 合 物 (将 要 采 用H I C 吸 附 剂 纯 化 的 样 品 ）的 盐 浓 度 ，目 的 在 于 使 目 标 蛋 白 质 能 够 与 吸 附 剂 结 合 。蛋 白 质在 高 盐 浓 度 下 可 能 发 生 沉 淀 ，所 以 ，在 选 择 盐 溶 液 之 前 , 应 先 评 估 蛋 白 质 复 合 物 在 给 定 盐溶 液 中 的 溶 解 性 。缓 冲 液 的 P H 对 于 蛋 白 质 结 合 于 H I C 吸 附 剂 的 影 响 并 不 呈 一 般 性 的趋 势 , 但 是 可 以 影 响 相 互 作 用 的 强 度（Hjertte etal.，1974)。 选 择 缓 冲 液 的 p H , 应 该 确保 蛋 白 质 和 吸 附 剂 在 该 环 境 下 能 够 稳 定 (如 避 免 使 用 极 端 P H 溶 液 )。在 调 整 蛋 白 质 上 样的 步 骤 中 ，盐 的 浓 度 可 以 为 〇. 5〜 2. 0 m o l /L , 并 且 可 提 髙 浓 度 以 确 保 蛋 白 质 能 够 有 效 结合 于 吸 附 剂 。蛋 白 质 结 合 于 吸 附 剂 所 需 要 的 盐 浓 度 在 很 大 程 度 上 取 决 于 盐 种 类 的 选 择 ，如 3. 2 部 分 所 述 盐 种 类 。在 大 多 数 情 况 下 ，选 择 蛋 白 质 结 合 于 吸 附 剂 的 适 宜 盐 浓 度 需 进行 相 关 的 预 实 验 。

4. 吸附剂的准备

在蛋白质原料上样前，应首先采用与原料相似组分 (盐浓度）和 P h 的高盐浓度缓冲液平衡层析柱，以确保蛋白质可以紧紧地结合于吸附剂上。该步骤称为平衡。

平衡结束之后，用合适的流速将调整后的原料 (含有目标蛋白质）上 样 于 H I C 层析柱 。完成上样后，通常用平衡缓冲液清洗层析柱，再洗脱目标蛋白质。洗 脱前，额外的清洗步骤是为了去除不需要的蛋白质杂质。该清洗步骤所用的盐浓度处于中间水平—小于上样步骤时的盐浓度，但大于洗脱步骤的盐浓度。

5. 产物洗脱

蛋白质结合于吸附剂上之后，必须再将目标蛋白质洗脱, 并收集层析柱柱后的流出液 。多数情况下，洗脱过程用于将不需要的蛋白质从目标蛋白质中分离或者去除。不需要的蛋白质可能与吸附剂结合的不是那么紧密, 因而会先于目标蛋白质被洗脱。另外一些情况下，不需要的蛋白质会与吸附剂结合更加紧密，并会在目标蛋白质被洗脱之后仍与吸附剂结合。这种情况通常发生在 H I C 分离蛋白质多聚体时，目标蛋白质多聚体与吸附剂的结合比单体与吸附剂的结合更加紧密。在洗脱步骤中，流出液组分可能含有高纯度
产品, 但在其之前或之后也会含有大量的不需要的蛋白质杂质。洗脱过程 (梯度洗脱中)简图如图 25. 2 所示。图 25. 2 说 明 用 H IC 分离纯化时，在洗脱步骤中，应将柱后流出液进行等份收集，这样才可以获得适宜纯度的产品。在 本 章 3. 6 节中 ，将会进一步详细描述梯度洗脱过程。

洗脱过程，可采用分步 (等度) 或梯度方式进行。 4 种最常见的洗脱结合蛋白质的方法 (按照从最常见到最少见排列) 如下所述。

(1) 降低盐浓度 (相对于结合条件)。盐浓度的降低会相应地减弱蛋白质和配基间的疏水作用，进而蛋白质被》吸附并从层析柱上洗脱下来。

⑵ 加 入 有 机 溶 剂 。有机溶剂 (如乙烯或丙二醇) 的加人可以改变溶液的极性, 从而可以干扰疏水作用。

(3) 提髙盐浓度 (采用离液盐)。离液盐的加入可以干扰疏水作用。

(4) 加人去污剂。去污剂可以用做蛋白质置换剂, 主要用于 H I C 纯化膜蛋白 (Jansonand R y d e n , 1997)

在洗脱步骤中，将蛋白质从 H I C 吸附剂上洗脱的最常用方法是降低盐浓度。用 H I C纯化新的蛋白质组分时，同样首先采用该方法。上述其他方法的缺点在于，需要额外加人物质 (如离液盐和有机溶剂） ，而这些物质可能影响蛋白质的稳定性。但是 ，洗脱与吸附剂结合比较紧密的蛋白质时，还是需要这些试剂的。每种蛋白质都必须逐个评价，以确定采用适宜的洗脱方法。纯化过程中所用的 H I C 吸附剂也可能影响洗脱方法的有效性。

6. 梯度洗脱

蛋白质纯化中，梯度洗脱是一种用于筛选不同 H I C 吸附剂的十分有效方法。梯度洗脱 时 ，盐的浓度以设定的体积，从高到低逐渐降低 (线性方式)。初次筛选与蛋白质结合的吸附剂时，盐浓度甚至会降低至0mmol/L ，以便于确定产品洗脱时的盐浓度。典型的梯度洗脱通常以 10 个柱体积洗脱缓冲液作为起始点，收集流出液组分并评价产品的纯度。降低盐浓度的梯度 (进行较大体积的洗脱时) 是为了提高蛋白质分离的分辨率 (Y a m a m 0-to et al.， 1988)。梯度洗脱后，蛋白质仍处于与吸附剂结合的状态，表明应采用更弱的易溶盐使蛋白质与吸附剂结合或者选择更强的洗脱条件进行蛋白质洗脱。更强的洗脱条件包括使用有机溶剂。制备规模中，通常采用不易燃烧的有机溶剂（如丙烯或乙二醇)。分析规模所用的有机溶剂可能为乙腈和乙醇。同样，对于疏水结合能力较弱的吸附剂，可能需要相应地选择减弱疏水作用的强度。

7. 分步 (等度) 洗脱

在确定合适的吸附剂及有效洗脱目标蛋白质的盐浓度后, 如需要也可采用等度洗脱。采用等度洗脱的优点即为其简单性—只需要简单地转换输人缓冲液 (从高到低的盐浓度)。如需简化对设备的要求, 那么等度洗脱就是一种优选方法, 而梯度洗脱则需要具有多个工作泵的设备, 同时要求对缓冲液盐浓度的线性变化过程进行控制。

8. 吸附剂的再生和清洁处理

多个循环的层析分离后，H I C 吸附剂仍是可以重复使用的，且具有相对较长的使用期限。但是 , 吸附剂也必须进行清洁和再生处理，以确保经历多次循环使用后其性能仍可重现 。吸附剂的供应商一般都会提供再生处理方法，在使用之前应仔细阅读。 一般地，清洁规程取决于基础介质和疏水性配基的稳定性。对于结合能力强的蛋白质，通常推荐采用 6 mol/L 盐酸胍。如之前的步骤中已使用去污剂,那么再生时采用乙醇或甲醇（GE
Healthcare, 2006)。 清洁处理时，腐蚀性的溶液（l.o mol/L NaOH) 可用于大多数的吸附剂 (SiO2 除外)。供应商同样还会提供适宜的储存条件信息。吸附剂储存溶液的选择应基于可防止微生物的生长，但同时又不会影响配基或基础介质的稳定性。