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    基本方案2 转染原代气管上皮细胞

    最新修订时间：

    材料与仪器

    聚凝胺 HamF-12培养基
    原代气管上皮细胞培养皿 针筒过滤器 MWCO 分析膜

    步骤

    用反转录病毒转染 木 la. 从汇合的单层克隆少Crip生产细胞或其他经典的技术，包括瞬时转染（ 单 元 12 4) 获取反转录病毒上清液。对于克隆生产细胞系，在 收 获 前 I6 〜 18h 加 入 5ml D M E M /10%小牛血清生长培养基到100m m 汇合的单细胞层。 2a. 将反转录病毒上清通过〇.45p m 过滤器，除去细胞残片。加 入 8m g /m l 聚凝胺，最 终浓度是2jug/ml。 3a. 在接种后的第二天（ 约 1 0 % 汇合度） ，从新接种了分离出的气管上皮细胞1〇〇mm 的培养板中移去培养基，加 入 IOml反转录上清。孵 育 2h 。用 H a m F-12培养基洗 细胞两次，再加入激素确定的培养基C ，继续孵育。在后面的几天里最多转染细胞 三次。 转染后，细胞可用来产生遗传修饰的气管上皮细胞用于支气管的异种嫁接（ 基 本方案6 ) 。通常， IXlO6cfu/m l 的反转录病毒滴度能够转染原代气管细胞，在三 次连续的转染后获得1 0 % 〜3 0 % 的转染效率。 利 用 r A A V 转导 lb. 制备并纯化r A A V (单元12. 3)。用 12 000〜14 OOODa M W C O 透析膜4°C 过夜透析 500m l H am F -12培养基。室温下，将 5 X 109rA A V 的 D N A 颗 粒 （—般 5〜1 0 0 l) 与 1. 5m l 培养基C 混匀。 2 b. 取一 l〇〇m m 培养皿的初级气管上皮细胞（ 新鲜分离的或传代—次的） ，约 5xi〇s 个细胞去除生长培养基。加 入 I.5ml r A A V /培养基C 混合物，孵 育 ih，每 隔 5〜 IOmin摇动一次。加 人 5m l 培养基c 后继续再孵育24h。 一般单次转染能产出2 5 % 转基因表达的细胞。为提高基因转移水平转染可以 在连续几天内进行提高。

    来源：丁香实验

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