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    基本方案4 基因转移极化气管上皮细胞

    最新修订时间：

    材料与仪器

    HBSS 蔗糖溶液 乳糖保存缓冲液 Ussing chamber 培养基 MilliceU-HA 培养板嵌入物 HamF-12培养基 PBS
    过滤器 离心机 Filtron 100K 浓缩器 水浴箱 MWCO 透析膜

    步骤

    la. 反转录病毒上清液用于基因转染研究（ 单 元 12.4)。确保含反转录病毒培养基通过 0. 45^111过滤器。效价大于108cfu/ml。 2 a . 在带有S S - 3 4 转 子 （40ml/管）的 4°C Sorvall R C - 2 6 Plus离心机中7000g 离心反转 录病毒1 6 h 。 去除上清液，用 0• 5 m l H B S S 重憙沉 淀 。 3 a •在S W 41离心管底部加入4ml 4 0 % 用 H B S S 稀释的蔗糖，用吸管慢慢加入2 5 % 的蔗 糖形成一个2 5 % 〜 4 0 % 的蔗糖梯度。将病毒悬液加入梯度的顶部， 4°C ， 2 6 5 O O O g 离心I.5 h 。 4a. 从界面收集病毒，按操作手册用Filtron 100K 浓缩器渗析，将缓冲液换成乳糖储存 缓冲液。病毒原液保存在一80°C (单元12. 4)。 5a. 加入8m g /m l 聚凝胺使终浓度为8pg/ml。用等体积Ussing chamber培养基与反转 录病毒混匀，加 lOOjul到极化气管上皮细胞的顶端表面。也可以翻转过滤器，将 100/J 病毒加到上皮的基底面。孵育4h。 典 型 的 反 转 录 病 毒 转 导 是 从 培 养 的 极 化 顶 端 面 进 行 极 少 的 基 因 转 染 ，其 效 率 为 1 % ~ 5 % 0 6a. 去除含病毒的培养基，将单层上皮放入普通培养条件下（ 顶上面有空气，底部有培 养基） 。 7a. 分析培养物功能或检测转基因转达。 用 r A A V 转染 lb. 通 过 CsCl三次密度超速离心纯化r A A V (UNIT 12. 3)。 58°C 加 热 60min失活 辅助腺病母用12 000〜14 OOODa M W C O 透析膜4 C 过夜透析500ml H a m F-12 培养基。 2b. 100^1 Ussing chamber培养基中混人5〜20^1 r A A V 。用 IOOjlj J 直接极化上皮细胞。 或倒转过滤器用IOOiUl感染底部。孵育24h。 比起顶端感染，底侧感染有100倍的高效率（ 感染后， 30〜40d 有 1 % 的转基 p 表达） 。 3b. 去除含病毒的培养基，将单层上皮放入普通培养条件下（ 顶上面有空气，底部有培 养基） 。 4b. 分析培养物功能或检测转基因转达（ 感染后4d 开始检测，高峰是第40天） 。 用腺病毒转染 l c . 一般的重组腺病毒（ 单元 1 2 . 2 ) 。 用 P B S 稀释腺病毒到5X 107pfu/l(%l ( [ M O I ] 约 50pfu/细胞） 。加 IOOjuI到顶部极化的上皮细胞上。孵育至少12h 以上。 2c. 去除含病毒的培养基，用 Ussing chamber培养基冲洗顶部表面两次。使培养箱转回 正常的培养条件（ 顶上面有空气，底部有培养基）
    3c•分析培养物功能或检测转基因转达（ 转染后 3(1舰 高峰期） 。 达细月包。 很 难 鉴 别 的

    来源：丁香实验

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