基本方案3 生成极化的单层气管上皮细胞

最新修订时间：2024-05-13

原理

材料与仪器

冰乙酸胶原Ⅵ PBS 血清气管培养基 Ussing chamber 培养基
过滤器培养板嵌入物组织培养皿桌面离心机 24孔培养板

步骤

$1. 将5〇4冰乙酸加到25m l 蒸馏水中，加 12.5m g 人胎盘胶原VI，轻轻搅拌37°C 溶解 30min。用蒸馏水1:1〇稀释，通过〇.2r m 过滤器（终浓度为5(V g /ml; 4°C 保存不超过1 个月） 2. 将 5004稀释的胶原加到12m m MUliceU-H A 培养板嵌人物表面，室温孵育18h 以上 (小于1 周）进行包被。 3 . 在使用前，去除多余液体胶原。自然风干3〜5min。用 P B S 洗一次， 5 % 血清气管培养基洗两次。 4•分离出原代气管上皮细胞（基本方案1，第 1〜8 步）或采用第一代细胞（基本方案 1，第 1〜12步；没有那么有效）进行第6 步。 5 . 轻轻吹打重悬细胞，接种到I O O m m 组织培养皿，孵育1〜3h 使成纤维细胞贴壁。收集上清液，上清液中包含未贴壁的原代上皮细胞。台盼排除法计数活细胞数（附录 31)， 300g 离心 5min〇 6 . 在 4 孔培养板的每个孔内加入5004 5 % 血清气管培养基，每个孔放置一个胶原包被的 Millicell嵌入物。在总体积为100〜5 0 0 4 的 5 % 血清气管培养基中，每个嵌入物上接种3\105原代气管细胞（5父105个细胞/〇!12).(图13.5.1)。孵育2411。 7•去除顶端面（黏膜的）的培养基，在基底面（基底外侧的）用 Ussing chamber培养基取代5 % 血清气管培养基。细胞在气-液界面继续孵育。在培养的第一周内C O 2 保持 7. 5 % 以提高在交叉膜阻力较大情况下生成单细胞层的效率。在培养2 周后可以得到分化好的单层气管上皮细胞。典型的培养显示穿越上皮的阻力达到lOOOohm/cm2 以上。$

来源：丁香实验