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    基本方案1 分离人气管表皮细胞

    最新修订时间：

    材料与仪器

    人肺
    FBS HamF-12 培养基 膜酶 EDTA 胰酶抑制缓冲液
    解剖器具 组织培养皿 离心管 平台振动器 桌面离心机 镇铬合金或铜金属丝网 冷冻管

    步骤

    在冰上的组织培养罩中从人肺部切开支气管，将气管置于4°C 的培养基A 中。可以
    很容易地从第5 支气管中分离出。 2. 将分离出的气管置于盛满培养基A 的150m m 组织培养皿中。从气管外部除去多余的 外膜并将气管组织切成1〜2c m 的环状。将气管环横向切开暴露出气管表面。去除多 余的黏液分泌物。 3. 将样本放人含有35m l 培养基A 的 50m l 离心管 中 （ 加入足够的组织使总体积达到 45ml)， 4° C 振动孵育3〇 min。重复洗6 次。如果组织在收获时已经严重感染，就需 要增加润洗时间，总共为5〜6h。 4. 将样本放入一个新的离心管内，管内含有35m l 培养基A 和 0.1% (m /V ) 蛋白酶 I I V 型。 4°C 孵育36h。加人FBS，终浓度为10% (保证管中总量小于管体的75%)， 轻轻振动30s。 5. 静置I m m 使得组织沉到管底。吸出培养基（ 含有分离的气管细胞） ，转入一个置于 冰上的新的离心管中，将剩下的组织放入到I O O m m 的组织培养皿中。 6. 用解剖刀的顿边刮气管表面，用 4°C H a m F-12培养基/10% F B S 润洗，将洗下的细 胞加入到50m l 离心管中。如果需要的话，将气管组织片保存在一8(T C 用于基因分型 检测。 7. 混合所有的含有上皮细胞的上清， 4° C ，约 3OOg 离心5min。弃去培养基，用总量为 IOml的 H a m F-12培养基/10% F B S 重悬细胞。用无菌的500jum金属丝网过滤到一 个 15m l 离心管中。 8•再用同样的培养基洗两遍细胞，离心收集。在最后一次离心前，移 除 1〇Jum等分量 的细胞悬液，用台盼蓝计数存洁细胞的释放总量（ 附录3 X ; —般一叶组织的释放量 为 2X 107〜4X 107个细胞） 。不要计入红细胞数。 9.用 IOml 37°C 培养基B 重悬最终的细胞沉淀，接种iXIO6〜2XIO6个细胞/IOOmm组 织培养皿，每个皿中加人IOml培养基B 。培养24h。如果使用囊性纤维化（ CF) 细 胞，在最初的24h 加倍抗体的浓度。 1〇•吸出未贴壁的细胞，用37。 (3 H a m F-12培养基洗两次贴壁细胞。用新鲜的培养基B 培养细胞，培养48h (重度污染的细胞培养72h)。 两 性 霉 素 B 对 细 胞 是 有 高 度 毒 性 的 ，如 果 不 是 真 菌 或 细 菌 污 染 的 问 题 ，加药 时 间 控 制 在 最 小 值 。从 器 官 移 植 手 术 室 直 接 获 取 组 织 （ 较 病 理 实 验 室 ） 能 降 低 真 菌 污 染 。 11.用培养基C 培养细胞（ 这一时期，上皮细胞克隆在扩增，可见） 。每 3 天换新鲜的 ±替养基C 。通常情况下，细胞是为冻存、传代或移植到异种模型做准备的（ 基本方 $ 5)接 种 后 5^天 （ 约 8 0 % 汇合度） 。不要让汇合度超过8〇%，否则会开始分化。 . = 选择：移去培养基，用 5m l 0. 1 % 胰酶/E D T A 在 37°C 下孵育1〜3min，同时紧 关注细胞是否脱落（ 附录3 I )。加入5m l胰酶抑制缓冲液。轻轻敲打平板，收 ^ 细胞。 4°C ， 300g 离 心 5min，用培养基C 洗两次。用培养基c 按丨： 5 稀释传 代。可参见第11步。 通 常 ， 细 胞 可 以 扩 增 一 次 而 不 丧 失 在 异 种 模 型 中 的 分 化 能 力 。 U ^ 酶/E D T A 处理细胞，轻轻敲打平板收集细胞。 4。<3, 3OOg离心5m m ，用 Iml ’ -田胞冻存液（ 每 1Q G m m 平板的细胞)重悬细胞沉淀。等分成im l加人到2ml
    的冻存管中。在一80<€冻存过夜，在转入液氮中（ 附录31)。 14.用冻存细胞时，在 37° C 下快速解冻，并立即接种到37°C 的生长培养基中。没有必 要移人到D M S ◦ 中

    来源：丁香实验

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