原代神经元的磁辅助转染
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实验原理
实验试剂
1. 分离液:含0.25%D-葡萄糖的HBSS(无钙,镁),保持在4°C,现配现用。
2. 培养基:MEM中加入10%的Nu-血清,15mM的pH值7.2的HEPES,0.45%葡萄糖,1mM丙酮酸钠,2mM的L-谷氨酰胺,10 IU/ml的青-链霉素。
实验设备
实验材料
实验步骤
1) 原代神经元细胞:一般来说培养了7至21天的细胞都可以进行实验,但体外培养天数(DIV)为10-15天(依据不同的培养条件)的细胞用来实验,其结果是最好的。转染前24小时更换50%的培养基。
2) DNA:稀释指定数量的DNA至50~700微升的无血清和补充的培养基中
3) 将上述DNA溶液加入到NeuroMag溶液中,涡旋或吹打后在室温下孵育15至20分钟。
1) 将NeuroMag / DNA复合物逐滴添加到培养的细胞(细胞> 10 DIV时,生长于营养培养基中,如果<10DIV,则培养于培养基中),轻拍培养板以确保均匀分布,于15分钟内置于磁板之上。
3) 细胞在37°C 标准条件下于CO2 培养箱中培养,直到用于评价转基因表达(24小时至7天)。
虽然上述快速方法转染效率较高,但在特定的细胞系或原代细胞培养中,可能需要优化如下几个参数以获得最高的转染效率:核酸的剂量、NeuroMag与核酸的比例、细胞密度和孵化时间。建议您一次优化一个参数。
首先保持一个固定数量的DNA(根据您的培养皿中,细胞数量和以前的优化结果),然后在2至5μL的范围内调整每微克DNA中NeuroMag的量。
细胞数量(密度)也是一个重要的参数,为达到良好的转染效率,根据所使用的细胞进行调整的最佳调整。合适的细胞密度取决于增长率和细胞的培养条件,同等条件下,较好的细胞融合度比低细胞密度好。
在对多个质粒DNA进行共转染时,将每个质粒取相同数量进行混合,再依如上所述条件进行转染。例如,如果你有两个DNA质粒,则每质粒取1微克,再与7μL的NeuroMag混合,进行实验。
共转染只能实现顺序转染,而不能同时进行。因此,一个细胞在转染质粒DNA4小时至24小时以后可以与其他质粒DNA再进行转染。两步转染之间可以更换培养基。
注意事项
1. DNA和 NeuroMag溶液在使用前应回复至室温,并轻柔涡旋。每微克DNA使用3.5µL的NeuroMag并实验需要来进优化。
2. 神经细胞系:建议在转染前一天将细胞培养于玻片上。合适的细胞密度取决于增长率和细胞的条件。在转染期间细胞不应该少于60%的融合度(细胞覆盖生长表面的百分比)。