P C R 检测人 T 细胞受体基因的表达

基本方案 PCR检测人 T 细胞受体基因的表达

$材料（带V 项目见附录 1) 5(^111〇 1/1^的1\^引物（表 14.6.1，一20°(：保存）无菌水 n/10X 无 ]^§(312的 P C R 扩增缓冲液和 15m m o l / L M g C l 2 0 •01M g/M l c D N A (见辅助方案 2) 2. 5U /M1 Ta g D N A 聚合酶矿物油用 I X T B E 电泳缓冲液配制1.5% (m /V ) Nusieve G T G 琼脂糖/ 0 . 5 % 琼脂糖变性溶液： 0.5mol/L N a O H /l.5m o l / L N a C l (室温保存）中和溶液：〇 .5mol/L T r i s . C l (p H 7.0) /L 5m o l / L N a C l (室温保存） V 20 X S S P E 1 % (m/ V ) SDS 杂交溶液辣根过氧化物酶标记的寡核苷酸探针 I X S S P E /1% (m/ V ) S D S 0.1X S S P E / 1 % ( m A O S D S V P B S 增强化学发光（E C L ) 基因检测系统无菌的 0. 5m l 聚碳酸盐离心管无菌的 I.5m l 离心管 P C R 仪$

尼龙膜紫外交联仪热密封杂交袋 X 射线胶片注意：在处理人血或人的组织样本时，必须按照生物安全程序（前言）执行。表 14.6.1 T 细胞受体扩增引物a Ct引物序列 13 引物序列 Val 5 '-TTGCCCTGAG AGATGCCAGAG-3， Vpi 5,-GCACAACAGTTCCCTGACTTGCAC-3, V«2 5 '-GTGTTCC AG AGGG AGCC ATTGCC-3 ’ V«3 5，-GGTG A AC AGTC A AC AGGG AG A-3， Va4 5 ^ AC A AGC ATT ACTGT ACTCCT A-3 ^ Va5 5 '-GGCCCTG A AC ATTC AGG A-3; Va6 5，-GTC ACTTTCT AGCCTGCTGA-3 ’ Va7 5 '-AGGAGCC ATTGTCC AGAT AA A-3 ’ Va8 5，-GGAG AG A ATGTGG AGC AGCATC-3 ’ Va9 5 ,-ATCTCAGTGC-TTGTGATAATA-3, ValO 5 ACCC AGCTGCTGG AGC AG AGCCCT-3? V a ll 5 '-AGA AAGCA AGGACC A AGTGTT-3 ’ Val 2 5 '-C AG A AGGT A ACTC A AGCGC AG ACT-3， Val3 5 ^GCTT ATG AG A AC ACTGCGT-3 ^ VaH 5 '-GCAGCTTCCCTTCCAGCAAT-3’ Val5 5 AG A ACCTG ACTGCCC AGG A A-3' Val 6 5 ATCTCCATGG ACTC AT ATG A-3’ Vod 7 5 '-G ACT AT ACT A AC AGC ATGT-3 ， Val 8 5 '-TGTC AGGC A ATG AC A A G O ^ Vcd 9 5 '-CTCGGT AGGA AT A AGTGC-3' Va20 5 '-C ATGG ACTC A T ATG A AGG AC A-3' Va21 5 ^GACTAT ACT A AC AGC ATGT-3' Va22 5，-TGTC AGGC A ATG AC A AGG-3， Ca Sr-AATAGGTCGACAGACTTGTCACTGGA -37 Ca 探针 5’-GTGT ACC AGCTG AG AG ACTCT A-3' Cj35' 5 ^-GAGGACCTG A AC/ (A) AAG/ (C) GTG-3 ^ C^3, 5 l CATTC ACCC ACC AGCTC AGCT-3 ’ Actin 5r 5,-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3, Vj32 S'-TCATCAACCATGCAAGCCTGACCT-S' Vj33 5 ^-GTCTCTAG AGAGA AG AAGG AGCGC-3 ^ V|34 5 '-ACGATCC AGTGTC A AGTCG AT-3 ， Vj35.1 5，-ATACTTC AGTG AG AC AC AG AG A-3， VP5. 2 S^TTCCCT A ACT AT AGCTCTG AGCTG-3, Vj36 5 '-AGGCCTG AGGG ATCCGTCTC-3' Vj37 5 '-CCTG A ATGCCCC AAC AGCTCTC-3? V(38 5,-ACTTTAACAACAACGTTCCGA-3, Vj39 5 '-CT A A ATCTCC AG AC A A AGCTC AC-3' Vj310 5，-TCCAAAAACTCATCCTGTACCT-3 ， V p il 5 '-TGTTCTCA A ACC ATGGGCC ATG AC-3' V|312 5?-GATACTGACAAAGGAGAAGTCTCAGAT -3' Vj313 5 ^-GGTG AGGGT AC A ACTGCC-3 ^ Vj314 5 '-ACCC A AG A T ACCTC ATC AC AG-3; Vj315 5 AGTGTCTCTCG AC AGGC AC AG~3' 邪 16 5 ^CATG AT AATCTTT ATCG ACGTGTT-3' Vpl 7 5 '-TTTC AG A A AGG AG AT AT AGCT-3' Vpl8 5 '-AGCCCA ATG A A AGG AC AC AGTC AT-3' Vpi 9 5 '-ACCCCCG A A A A AGG AC AT ACT-3' Vj320 5 '-CTCTGAGGTGCCCCAG AA-3 ’ vp2i 5^ c c t a t t t c t g g c c a t g c t a c c c t t -s' V|322 5 ^g a t c a g a g a a a a g a g g g a a a c -s; V1323 5 ^ a t g a a a t c t c a g a g a a g t c t -s, V^24 5,-TACCCAGTTTGGAAAGC-3, Cp 5 ^TTCTG ATGGCTC A A AC AC-3' QB探针 5'-TTCCCACCCGAGGTCGCTGT-3， Cj35， 5 '-ATCCAGA ACCCTG ACCCTGCC-3， Ca3f 5 ATCAT A A ATTCGGGT AGGATCC-3， Actin 3, S'-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG^

1 . 用无菌水将5〇 ium〇l/L 的 Vcx和 V p 寡核苷酸引物稀释到5|u m 〇l/L 的浓度。取 5/xl稀释的 T C R V 引物加入到0. 5m l 无菌聚碳酸盐离心管。 2 . 准备 2 个 1.5m l 无菌离心管，一管放置《家族的反应体系，另一管放置卩家族的反应体系。分别在 2 管中加入以下的反应物（45/xl/次反应）。配制时应当比待测样本数多配制1 或 2 份以防止使用移液器时的损失。 4M1 I O X 扩增缓冲液 10/ixl c D N A (0. 1/xg) 0 •5/xl 50]umol/L C a 或 C ⑶寡核苷酸引物 0 •5M1 2. 5U /V 1 T a g D N A 聚合酶 30jLtl无菌水。振荡，瞬时离心，分装前置于冰上。 3 . 将 45M 1反应液加入到分别含有 Vcx和 V P 57寡核苷酸引物的离心管中。轻轻振荡，在室温下以最大速度离心，加一滴矿物油以防蒸发。 4 . 用下例参数扩增样本： Imin 93°C 变性 Imin 55 °C 复性 Imin 72°C 延伸。对于来自外周血白细胞的c D N A ，进行 2 5 个循环扩增 T C R 转录产物；对于有少许淋巴细胞浸润的组织c D N A ，扩增 3 5 个循环。 5 . 将油下层的扩增产物移到一个新的微量离心管中，取 1〜3；xl P C R 产物进行电泳（产物于 1.5% (m /V ) 的 Nusieve G T G 琼脂糖/ 0 . 5 % (m /V ) 琼脂糖电泳）；分别跑两块胶分析 ex、卩产物；溴化乙锭染色胶体，然后照相。 6 . 在变性溶液中浸泡凝胶30m i n ，然后在中性溶液中浸泡30m i n 。 7 . 通过 Southern印迹将D N A 印迹在浸泡于20 X S S P E (见 C P I 单元 10. 6A ) 的尼龙膜上，紫外交联剂固定膜；在 1 % S D S 中煮沸 3m i n 。将膜置于杂交袋中，随后放于 42°C 杂交溶液预杂交渗透15miri。每毫升杂交溶液加入 I p m o l 辣根过氧化物酶标记的 C a 和 C 卩寡核苷酸探针。 42°C 杂交 l h ; 然后室温下用 1 X S S P E / 1 % S D S 洗膜 15m i n ， 0.1X S S P E /1% S D S 洗膜 l O m i n ，P B S 洗膜 5m i n 。 8 . 加入底物（增强化学发光基因检测系统）赙育 l m i n ， X 射线胶片曝光（最初曝光 5m i n ，再调整时间）。备选方案 PCR定量检测TCR可变序列转录产物材料（其他材料见基本方案） 5 0 / ^ 1 〇 1 / 乙 1 ^ ^ 〇 3 3 % 0 ^ 和 0 ^ 引物（表14.6.1) 光密度计 1 . 每个 S O p m d / L T C R V P 5 1 丨物用无菌水稀释到3M mol/L 。无菌的薄壁 0 •5m l 的聚碳酸盐 P C R 管子加入5/xl稀释后的引物。 2 . 按下面的配方根据样品数在1.5m l 微离心管中配制反应原液（40pd/反应管）。多配 1

或 2 份防止加样时有损失。 4/1110乂扩增缓冲液 IOptl c D N A (0. IiUg) 0 •3jLtl 50/xmol/L C P 3'引物 0.3jul SOymol/L C c ^ 引物 0. 3ftl 50]umol/L C a 3'引物 25. 1/xl无菌水。振荡，瞬时离心，放于冰上。在每个反应管加入40M 1原液，用最大速度短暂离心。 3 . 同上在无菌1.5m l 离心管准备热启动溶液（5M 1/反应管）： 4. 5jLtl 2. 5m m o l / L 4d N T P 0 •5/xl 2. 511/4 Ta g D N A 聚合酶。振荡，离心到管底。放置于冰上。 4 . 转移样品到P C R 仪上预热到 80°C 。迅速（8m i n 内）加入 5M 1热启动溶液。并用移液器上下吹动使得充分混匀。加入一滴矿物油避免样品蒸发。 5 . 扩增参数如下： Imin 93 °C 变性 Imin 55 °C 复性 Imin 72°C 延伸。外周淋巴细胞为1 5 个循环，组织为 20〜2 5 个循环。定量分析需要检测对数扩增期的产物，必须调整循环数。 6 . 取 10〜15卜1 P C R 产物跑 1. 5% (m /V ) NuSieve G T G 琼脂糖/0•5% (m /V ) 琼脂糖胶。溴化乙锭染色， U V 紫外透照仪下观察结果，确认没有条带。 7 . 印迹、交联和预杂交薄膜见基本方案步骤7。在杂交液中加入 lpmol/ml H R P 偶联的 C a 和 C 卩寡核苷酸探针。 42° C 孵育 l h 。薄膜先用1X S S P E /1% S D S 洗 15m i n ，然后 0.1X S S P E /1% S D S 洗 l O min。最后 P B S 洗 5m i n 。室温进行。 8 . 薄膜在增强化学发光基因检测系统显影 l m i n 。室温下 X 射线胶片曝光 l m i n、 l Omin、 30m i n 或者过夜。显像密度仪定量不同曝光时间的杂交产物强度。曝光过夜，检测有无非特异性条带。 9 . 用每个 V (3家族曝光三次的数据作图，确定定量分析的最佳曝光时间。在实验中选择处于指数期的曝光时间。定量表达 T C R V 卩转录物作为共扩增C a 转录物相对百分比标准。辅助方案 1 重排 V-D -J 区测序特定 T C R 家族的 P C R 产物进行测序，检测扩增转录物的 V -D - J 重排情况（图 14. 6. 2)〇附加材料（其他材料见基本方案，带7 项目见附录 1) C l o n e A m p 克隆系统（G I B C O /B R I ) 包含： p A M P l 质粒

图 14. 6. 2 鉴定丁细胞受体PCR产物的 V-D-J重排。 25叫/卜1 l U //xl尿嘧啶-D N A 糖基化酶 I O X P C R 缓冲液 D H 5cx感受态细菌 50/^m o l / L T C R 上游引物（V 引物）带 5'端接头 S ' - C U A C U A C U A C U A l 50jumol/L T C R 下游引物（C 引物）带 ^ 端接头 S'-C U A C U A C U A C U A -S’ V L B 培养平板含50M g/m l 氨苄青霉素 V T B 培养基 0.7% (m /V ) 琼脂糖凝胶测序酶 2. 0 版 T 7 D N A 聚合酶试剂盒： 5X 复性缓冲液： 200mmol/LTIiS •Cl(pH7.5)/100mmol/LMgCl2/250mmol/LNaCl O.lmol/L 二硫苏糖醇（D T T ) 标记的核苷酸混合液： d G T P 、 d C T P 和 d T T P 的浓度均为1.5m m o l / L V 终止核苷酸混合液 V 终止液：酶稀释缓冲液： l〇m m o l / L Tris •Cl (p H 7.5) / 5m m o l / L D T T /0.05% (m /V ) B S A ， 200U 或者是 1000U 测序酶 2. 0 版 T 7 D N A 聚合酶 Centricon-IOO 离心过滤器和尖头帽（Perkin-Elmer Vetus) Backman J2-21M离心机和JA-20转子 37°C细菌培养箱，具有摇动功能 1 . 准备 P C R 反应液（100M 1反应体系），扩增感兴趣的T C R 家族。 8/xl I O X P C R 缓冲液

$2(^1 cDNA (0 •2Mg 稀释于PRC扩增缓冲液） 1M1 50/xmol/L 5 ¾ 带接头的T C R 上游引物（V 引物） Iyl 50M m 〇l/L 5'端带接头的T C R 下游引物（C 引物） Iyl 2. 5U /M1 T 叫 D N A 聚合酶 69/xl无菌水。振荡混合，瞬时离心，使得液体沉于管底。加入一滴矿物油。 2 . 扩增参数： 3 5 个循环： Imin 93°C 变性 Imin 55 °C 复性 Imin 72°C 延伸。 3 . 转移 P C R 产物到干净的管子，并转移到 Centricon-I O O 微型离心凝胶过滤柱。加入 2ml 无菌水， 4°C ， 5000r/min 离心 15m in 。再加入 2ml 无菌水， 4°C ， 5000r/min 离心 15m in 。弃去离心下来的液体。盖上尖头帽。颠倒柱子， 4°C ， 3000r / m i n 离心 5m i n 。转移尖头帽里纯化的P C R 产物到无菌的 1.5m l 微离心管。如果纯化产物 > 50|ul，用 Speedvac脱水器浓缩反应产物。 4 . 克隆前，琼脂糖电泳和Southern印迹检测1〜 P C R 纯化产物确保是T C R 家族转录产物。 5 . 利用 C l o n e A m p 克隆体系克隆T C R 转录产物。连接 50ng P C R 产物和 50ng p A M P l 载体。 30n g 连接产物转化D H 5a 。转化的细菌涂于含 50M g/m l 氨苄青霉素的 L B 平板。 37°C 培养箱过夜。通过在淡化乙锭染色的凝肢上和已知浓度的 m a r k e r 比较条带亮度来对 P C R 产物进行定量。 6 . 挑取单个克隆到2m l L B 培养基中， 37°C持续振荡摇动过夜。碱裂解法（C P I 单元 1 0 . 3 ) 提取质粒D N A 。在 0 . 7 % (m / \ 〇的琼脂糖电泳及同Ccx或者 C p 探针杂交，用增强化学发光试剂检测是否插入。 7 . 测序酶 2. 0 版 T 7 D N A 聚合酶试剂盒对阳性克隆测序。辅助方案 2 cDNA合成材料（带V 项目见附录 1) 新鲜或冻存的组织或者是外周血淋巴细胞 " 1 〇 \ 不含 ] ^ ^ ( ：12 的？ 0 1 缓冲液， 15111111〇 1/乙 ]^^12 x/2. 5m m o l / L 4d N T P 混合液 50 A 26。U 6 碱基随机引物序列（Pharmacia Biotech)，重悬在 Iml D E P C 水中 10U /M1人源胎盘 R N a s e 抑制剂（G I B C O /B R L ) 200U//xl Superscript M u L V H 反转录酶（G I B C O /B R L ) V D E P C 处理过的无菌水 1 . 胍盐法提取50m g (湿重）新鲜分离或冻存的组织样本，或者 5 X 106外周血淋巴细胞 (CPI 单元 10. 11)。$
$RNAzol B 法（Tel-Test) 也能得到 R N A 0 假如组织很难捣匀（如骨骼肌），放到灭菌的无 R N a s e 的研钵，在液氮冻存。等到大部分液体蒸发，杵捣用力碾磨成粉末，要避免组织解冻。转移粉末到灭菌的无 R N a s e 的匀浆器中，置于冰上，加入胍溶液提取 R N A p 2 . 在无菌的1.5m l 离心管中加入下列试剂： 5]ug 总 RNA 50^110\扩增缓冲液 5 0 0 2. 5mmol/L 的 4d N T P 混合液 6. 7U 6 碱基随机引物序列 250U 人源胎盘R N a s e 抑制剂 5000U Superscript M u L V H 反转录酶无菌 D E P C 水补至 500M1。振荡混匀，瞬时离心 3 . 室温孵育 l O m i n， 37°C 孵育 60m i n ，然后 95°C ， 5m i n 。迅速放于冰上冷却。一20°C 保存。此方案根据 E . S . Kawasaki ( 1 9 9 0 ) 改编， 5/xg 总 RNA 合成 SOO1L d c D N A ，足够完成表 14. 6. 1 中所列引物来鉴定 TCRcx和 (3家族的研究实验。检验 c D N A 反应是否成功，可通过测量 A 26。或者在溴化乙锭染色的琼脂糖胶上出现一片模糊条带来确认。$

来源：丁香实验

P C R 检 测 人 T 细 胞 受 体 基 因 的 表 达

基 本 方 案 PCR检 测 人 T 细胞受体基因的表达

P C R 检测人 T 细胞受体基因的表达

基本方案 PCR检测人 T 细胞受体基因的表达