抗大鼠ic链单克隆抗体交联琼脂糖凝胶亲和层析

 

一般情况下，单 克 隆 抗 体（尤其是大鼠源性）不能用 蛋 白A 或 蛋 白 G 交联琼脂糖凝胶层析纯化，在此情况下，可使用抗大鼠Ig 轻链单克隆抗体交联琼脂糖凝胶层析柱来结合组织培养上清或腹水中的大鼠单克隆抗体，然后用逐步降低洗脱液p H 的方法来确定从抗Ig柱上洗脱大鼠抗体的最温和洗脱条件。

附 加 材 料（其他材料见基本方案2)

小鼠抗大鼠/ c链 MAb: 用 蛋 白 A 交联琼脂糖凝胶纯化的MAR18.5 (ATCC) (见基本方案2)

溴化氰活化的琼脂糖凝胶CL-4B (单元12. 2; Pharmacia Biotech)

结合缓冲液：0.05mol/L Tris •HCl (附录 I ) /0.15mol/L
NaCl/0.02% (m/V ),NaN3， pH8. 6

待纯化的大鼠抗体粗提液（MAb上清或腹水，单 元 I.4)

PH7.0 洗脱缓冲液： 0.05mol/L 磷 酸 钠（附录 I) /0. 15mol/LNaCl/0.02% (m/V),NaN3， pH7. 0

pH5.5 洗 脱 缓 冲 液 ： 0.05mol/L 柠 檬 酸 钠 / 0.15mol/L NaCl/0.02% (m/v) NaN3， pH5. 5

pH4. 3 洗 脱 缓 冲 液 ： 0 •05mol/L 乙 酸 钠 / 0 •15mol/L NaCl/0. 02 % (m/V )NaN3， pH4. 3

pH2. 3 洗 脱 缓 冲 液 ： 0 •05mol/L 甘 氨 酸 /0•15mol/L NaCl/0. 0 2 % ( m/V )NaN3， pH2. 3

1.将≥1 0 mg纯 化 后 的 MAR18. 5 抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B 共价偶联， Iml湿凝胶约可以偶联IOmg左 右 的 MAR18. 5 抗 体 ，此 柱 可 结 合 Img左 右 蛋 白 质（单元 12. 2)，将偶联的凝胶在4°C或室温下用结合缓冲液冲洗。

2.提 纯 腹 水 或 M A b上 清（见 备 选 方 案 1 ，步 骤 I a 或 lb) ，将含大鼠抗体粗提液的IOml左右腹水或IOOml左 右 MAb上清上样。

3.用 10〜1 5 倍柱体积的结合缓冲液洗柱，监 测 A₂₈₀值 ，使其回到基线水平，放置组分收集器准备收集洗脱液。

4.分别用以下洗脱液各洗脱5 个柱体积，在用下一个洗脱液之前要确定A₂₈₀已回到基线。

pH7. 0 洗脱缓冲液

pH5. 5 洗 脱 缓 冲 液（某些抗体会洗脱）

P H 4. 3 洗 脱 缓 冲 液（多数抗体会洗脱）

P H 2. 3 洗 脱 缓 冲 液（所有抗体会洗脱，洗 到 A₂₈₀回到基线）

5.用≥1 0 个柱体积的结合缓冲液平衡层析柱，置 于 4°C保存。

6。鉴定洗脱的蛋白质峰（包括未结合的洗脱组分），合并各洗脱液，检测抗体活性，如有必要，可 将 其 浓 缩 （见基本方案1 ，步 骤 6)。