硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析

 

硫酸铵沉淀可纯化小鼠抗体的所有亚类和其他种属抗体，本方案也可用于纯化任何种 属 的 IgM、 IgG 和 IgA。

材 料

腹水 或 MAb 上 清（单 元 1.4)

VPBS

饱 和 硫 酸 铵（SAS)

硼 酸 盐 缓 冲 液（可选）

聚丙燏酰胺葡聚糖凝胶 S-200 Superfine (Pharmacia Biotech)

含有 0. 0 2 % (m/VO NaN3 的 PBS (可选）

玻 璃 棉（Glasswool， Polysciences)

Sorvall 离心机， SS-34 型 转 子（或类似转子）

透 析 袋（无需按分子质量精确截断），保存于蒸馏水中

26 mmX 900 mm 层 析 柱（Pharmacia Biotech)

la. 适用于腹水：为了清除腹水中的脂类物质，可用足量玻璃棉盖住漏斗口，然后倒入腹水，再 用 PBS 充分冲洗玻璃棉，并戴好手套，轻轻挤压玻璃棉，收集全部样品(处理玻璃棉的时候请戴手套），将滤出液于 4℃或室温下， 20 000g离心 30min，轻轻倒出上清并保存，弃去含膜和细胞碎片的沉淀。

lb. 适用于 MAb 上清：将 M Ab 上清于 4°C 或室温下， 20 OOOg 离 心 30 min，轻轻倒出上清并保存。

2.边搅拌边慢慢向腹水或 MAb 上清中加入 SAS 至终浓度 4 5 % (V/V) ，静 置 1〜2 h 或4°C 静置过夜，保证使所有蛋白质沉淀。

3.4°C 或室温下， 20 OOOg 离 心 lh ，保留上清以检测抗体活性。用最小体积的 PBS 或硼酸 盐 缓 冲 液（10〜20 ml) 溶解沉淀并转移到透析袋中。于 4°C 在 至 少 2 0 倍体积的PBS 或硼酸缓冲液中透析 24〜48 h，在透析过程中更换透析液 4〜6 次 ，最后将蛋白质浓缩至≤ 5 ml (CPI附 录 3 H) 。

4.准 备 26 mmX900 mm聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-200 Superfine 层析柱，将浓缩的蛋白质 溶 液 上 样（CPI附 录 31)。 用 PBS，或 含 0.02%NaN3 的 PBS或硼酸缓冲液洗脱蛋白质，收集1〇〇个组分（每个组分为1 % 柱体积，约 4. 5 ml)。 在 280nm波长检测蛋白质组分。

5.用 非 还 原 型 和 还 原 型 1 0 % 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测A₂₈₀>0. 5 组分的蛋白质纯度(单元12. 3)。在 非 还 原 型 凝 胶 上 IgG 的 条 带 在 150kDa左 右 ，在 还 原 型 凝 胶 上 ，55kDa左右的条带为IgG重链 ， 25kDa左右的条带为IgG的轻链。 IgG2b的重链呈非对称的糖基化，通常以二聚体形式存在。

6.用分光光度计测定IgG A₂₈₀浓 度（表 1.5.1)。将 含 纯 IgG的洗脱液合并，用硼酸缓冲液或含0.02%NaN3 的 PBS调 整 IgG浓 度 至 0. 1〜30 mg/ml，可 在 4°C 保存数年。长期保存可以将IgG置于一70°C保 存 ，不要将抗体在一20°C储存超过一个月，要避免抗体的反复冻融。