蛋 白 A 交联琼脂糖凝胶亲和层析

 

蛋 白 A 通 常 用 于 人（除 IgG3 夕 h 小 鼠 IgG1 结合力也较弱）、兔 、豚鼠和猪抗体的纯化。

材 料

腹 水 或 M Ab上 清（单 元 1. 4)

PBS, pH8. O和pH7. 3

lmol/L NaOH

蛋 白 A 交联琼脂糖凝胶CL-4B (Pharmacia Biotech或 Sigma)

0.lmol/L 柠檬酸， pH 按照所分离的抗体亚类的需要而定（步 骤 3)

1 0 % (m/V) NaN3 (可选）

V 硼 酸 盐 缓 冲 液（可选）

3mol/L 过滤后的硫氰酸钾

玻 璃 棉（Polysciences)

Sorvall离心机， SS-34型 转 子（或类似转子）， 4°C

0.45um滤器，过 滤 MAb上清

透析袋

1.5 cmX10 cm层 析 柱（如铺有玻璃棉的IOml注射器）

组分收集器

蠕 动 泵（可选）

Ia 适用于腹水：用玻璃棉去除腹水中脂类（见 基 本 方 案 1 ，步 骤 la)，用 1 0 倍体积的PBS， pH8.0稀释腹水。

Ib. 适 用 于 MAb上清：于 4°C将 M Ab上 清 以 20 OOOg离心后 用 0 •45um滤器过滤。对于 IgG1 抗 体 ，用 透 析（对 pH8. 0 PBS) 或者加 入lmol/L NaOH的方法调整其PH到 8.0。对于其他抗体亚类则调整到pH7. 4 。

2.将 蛋 白 A 交 联 琼 脂 糖 凝 胶 CL-4B 装 入 1.5 cm X 10 cm层 析 柱 中 ，连上组分收集器(CPI附 录 31)。于 4°C 或 室 温 下 用 PBS， pH8 . 0 平衡层析柱。上 样（Im l至几升），当上样量大时，可用螭动泵或重力帮助上样。每 毫 升 胶 可 结 合 约 5 mg小 鼠 IgG或8 mg人 IgG。用 流 式 细 胞 仪（单 元 4.1、单 元 4. 2 ) 或 ELISA (单 元 1 . 1 ) 检测流出的未结合组分中的抗体活性，以判断上样量是否过量。

也可选择使用HiTrap A 蛋白子页装柱（ Pharmacia Biotech或Sigma)。

3.用 数 倍 柱 体 积 的 PBS， pH8 . 0 洗 柱 ，一 直 洗 到 A28q到 基 线 水 平 。用 适 当 p H 的0.lmol/L柠 檬 酸 缓 冲 液（用 lmol/L NaOH调 整）洗 脱 目 的 蛋 白 ：小 鼠 IgG1 用pH6. 5 、 IgG2a用 pH4. 5、 IgG2b和 IgG3 用 pH3. 0。低 pH会损伤抗体，因此洗脱前在收集管内按每毫升洗脱液加入5〇 4 2mol/LTris-HCl缓冲液，用于立刻中和酸。

4.合并含目的蛋白的组分，将合并组分倒入透析袋，用 含 或 不 含 有 0 . 0 2 % NaN3 的 IL PBS (pH7. 3 ) 透析，期间更换二次透析液，然 后 置 于 4°C 保 存 。必 要 时 可 用 SDSPAGE进行纯度鉴定。

5.层析柱可以先用1 倍柱体积的过滤后的3mol/L 硫氰酸钾清洗，然后再用数个柱体积的 PBSpH7.3洗柱，最后保存于4°C 。