原理
当 “ 三明治”结构中的滤纸浸透缓冲液时,半干印迹转移设备能将蛋白质从凝胶转移到膜上。和槽式印迹转移设备相比,半干印迹只用较少的缓冲液;因为电极板靠得很近,故转移时只要求较低的电压。
材料与仪器
含有蛋白质样品的凝胶
转移缓冲液
印迹纸 支持性纤维素膜或 PVDF 膜 电源 半干转移设备
转移缓冲液
印迹纸 支持性纤维素膜或 PVDF 膜 电源 半干转移设备
步骤
1.测量 SDS-PAGE 凝胶的尺寸,将转移膜与 6 层印迹纸剪切成与凝胶同样大小。
2.用水湿润膜或用甲醇湿润 PVDF 膜,缓慢操作,以避免膜不平整或在膜下产生气泡。
3.将湿润的膜转移到盛有转移缓冲液的平皿中,让其在缓冲液中平衡 5 min。
4.将印迹纸、膜与凝胶排列成「三明治」状,要避免产生气泡,因为气泡会阻止蛋白质的转移。最好按照以下方法操作:
(1)印迹纸和 B 吴要用转移缓冲液湿润,滚动玻璃棒来赶走气泡。
(2)将转移膜放在印迹纸表面。
(3)将凝胶放在膜上,注意一开始应将凝胶放在准确的位置,在膜上移动凝胶通常可能引起污迹;滚动玻璃棒除去膜与凝胶之间的气泡。
(4)再用缓冲液湿润三层印迹纸,将其放在凝胶上,滚动玻璃棒以赶走气泡。
(5)将电极连接好。
在电泳期间,蛋白质将从负极(黑色)迁移到正极(红色)。
5.按照操作说明所建议的时间与电流进行转膜。
6.转膜完成后,关掉电源,去掉盖子。
7.取出转移膜,去掉印迹纸,用软铅笔标记膜对着凝胶的一面。
不能用钢笔或记号笔,因为墨水会溶解在膜的转移缓冲液中。
8.对印迹膜进行染色处理(参见方案 17~20),或将膜干燥保存在两层印迹纸之间,置于暗处。
保存的膜在染色前,应用水重新湿润硝酸纤维素薄膜或用甲醇湿润 PVDF 膜。
2.用水湿润膜或用甲醇湿润 PVDF 膜,缓慢操作,以避免膜不平整或在膜下产生气泡。
3.将湿润的膜转移到盛有转移缓冲液的平皿中,让其在缓冲液中平衡 5 min。
4.将印迹纸、膜与凝胶排列成「三明治」状,要避免产生气泡,因为气泡会阻止蛋白质的转移。最好按照以下方法操作:
(1)印迹纸和 B 吴要用转移缓冲液湿润,滚动玻璃棒来赶走气泡。
(2)将转移膜放在印迹纸表面。
(3)将凝胶放在膜上,注意一开始应将凝胶放在准确的位置,在膜上移动凝胶通常可能引起污迹;滚动玻璃棒除去膜与凝胶之间的气泡。
(4)再用缓冲液湿润三层印迹纸,将其放在凝胶上,滚动玻璃棒以赶走气泡。
(5)将电极连接好。
在电泳期间,蛋白质将从负极(黑色)迁移到正极(红色)。
5.按照操作说明所建议的时间与电流进行转膜。
6.转膜完成后,关掉电源,去掉盖子。
7.取出转移膜,去掉印迹纸,用软铅笔标记膜对着凝胶的一面。
不能用钢笔或记号笔,因为墨水会溶解在膜的转移缓冲液中。
8.对印迹膜进行染色处理(参见方案 17~20),或将膜干燥保存在两层印迹纸之间,置于暗处。
保存的膜在染色前,应用水重新湿润硝酸纤维素薄膜或用甲醇湿润 PVDF 膜。
来源:丁香实验