方案2 双向凝胶电泳真核生物细胞裂解物的制备实验

在生物医学研究中，培养的哺乳动物细胞是被广泛使用的材料。本方案中介绍的方法已经成功用于许多人类克隆的癌细胞系和纤维原细胞系（Ji,etal，1994,1997)。虽然多数细胞蛋白质能用此方法提取，但是一些 DNA 结合蛋白可能会丢失。

如果研究 DNA 结合蛋白，应该使用核酸酶，此方法在方案 3 中详述。表达蛋白质组学的研究经常需要检测低丰度蛋白质，一种检测微量蛋白质的更可靠、更敏感的方法是对细胞蛋白质进行代谢物放射性标记，此方法的详细介绍见附加方案：用放射性同位素标记真核生物细胞蛋白质。具体步骤详见本方案的最后。

1.从培养皿中转移细胞。.

如果是贴壁细胞，用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞，用 5 ml 吸管将细胞和培养基转移到 15 ml 离心管中。

如果是悬浮细胞，直接将细胞和培养基转移到离心管中。

2.480 g、4°C，离心沉淀细胞 5 min。

3.弃去上清，勿搅动沉淀。

要点：操作以下步骤时，所有细胞需保持冰冻状态；不离心或振荡时，保持细胞在冰上。

4.在离心管中加 IOml 冰冻 PBS 洗涤细胞，来回吹打重悬细胞。

5.480 g、4°C，再次离心细胞 5 min。

6.弃去上清，勿搅动沉淀。

7.重复步骤4~6两次。

8.在最后一次洗涤后，把离心管完全空干，用滤纸将沉淀上残留的 PBS 吸干。

9.用吸管将抽提缓冲液加到离心管中。

依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。细胞裂解液的蛋白质浓度应为 10 mg/ml，不应超过 20 mg/ml。

10.旋涡混合器振荡离心管 10~30s，重新悬浮沉淀。

11.每 1Oml 抽提缓冲液中加 50ul IPG 缓冲液，IPG 缓冲液终浓度为 0.5%。

12.将细胞裂解液转移到一个合适的超速离心管中。

13.100000g 离心 20 min。

14.收集上清，小心避免试管底部的清澈黏性的液滴（DNA 和 RNA) 混入上清。

15.用 BCA 方法测定蛋白质浓度（见附录 2)。

注意：如果用 BCA 检测，要从抽提缓冲液中去除 DTT, 因为 DTT 会干扰分析。样品分析完之后，在样品中加 DTT 至终浓度为 50 mmol/L。

16.将上清分成几等份，每份 lOOjtxl 或 200 沁。

每一等份的大小取决于待测样品的量。如果不立即用于 IEF，将样品储存在一 80°C。

17.按方案 5 进行第一向 IEF。