原理
材料与仪器
二硫苏糖醇(DTT) 抽提溶液 苯甲基硫酰氟(PMSF)
液氮 低温离心机 研钵和研杵
步骤
1.取一些肝放入研钵中,如果事先没有被冰冻,可用液氮充满研钵来保持肝冰冻。用研杵将肝破碎成小块。
2.称量冰冻肝的小块 10~40 mg,将其转移至在冰上放置的离心小管中。操作应迅速以尽可能减少肝样品的解冻。将剩余的肝储存在一 80°C。
3.在有肝样品的离心管中,每 40 mg 肝加入 1ml 冷的抽提溶液。每 1ml 抽提溶液加 100 mmol/L PMSF。
4.用小研杵(其大小适合在离心管中使用)磨碎肝样品。
5.每 1ml 抽提物中加 50ul 1.2mol/L DTT,振荡。
6.在 4°C 对样品进行最大速度离心,lOmin。
7.检测上清的蛋白质浓度。
8.将上清分成每 100ul —份。若不立即用于 IEF,将其储存在一 80°C(样品只能冻融一次,以避免多次冻融造成的不利影响)。
9.按照方案 5 进行第一向 IEF。
进行第一向 IEF 时,以鼠肝为例,浓度应为 5~lOmg/ml。对第一向 IEF,样品可在包含 7mol/L 脲、2mol/L 硫脲、20 g/LASB-14 的水化液中被稀释成准确浓度。但是,若在水化的同时上样,IEF 胶条可负载相当大体积的样品。最适水化溶液可根据蛋白质来源和经验而灵活决定。
来源:丁香实验