双向琼脂糖凝胶电泳实验

【实验目的】
了解和掌握双向电泳技术，并学习用它来研究与DNA 复制相关的问题。
【实验原理】
DNA 分子有线状的，还有一些非线状的，如复制叉和重组DNA 结构。双向琼脂糖凝胶电泳技术就是被人们开发用以研究一些非线状DNA 分子的。双向琼脂糖凝胶电泳技术(2-D gel)实际上可分为两类：中性/中性双向凝胶电泳和中性/碱性双向凝胶电泳技术。它们的工作原理如下：
中性/中性双向凝胶电泳：非线状的DNA 分子在琼脂糖凝胶中的泳动行为和线状DNA 分子相比是不规则的。并且这种行为随着琼脂糖浓度或电压增加而加剧。而这正是中性/中性双向凝胶电泳的工作原理：在第一向中，样品在琼脂糖凝胶中以低琼脂糖浓度、低电压的条件进行电泳，则DNA 分子主要根据其分子量大小被分离。在第二向中，则采用高浓度琼脂糖凝胶和较高电压条件，DNA 分子的分离则主要根据其形状。
中性/碱性双向凝胶电泳：此方法适合用来分析DNA 复制中间体。这些中间体包括各种长度的新链部分。在第一向中与中性/中性双向凝胶电泳一样采用中性pH，将DNA分子按其分子量大小分开。在第二向中，采用碱性pH，使DNA 复制中间体中新链部分释放，并按其长度分离，如同在普通琼脂糖凝胶中一样。
双向凝胶电泳在分析DNA 结构方面，最大的特点就是简便易行。它已成功地应用于酵母DNA 复制起点的定位、确定酵母复制叉阻抑点以及DNA 复制抑制剂机理的研究等。但双向电泳也有一定的问题，如得到的图像与理论上的图像不吻合，而且很难解释。如果电泳条件不当，还会产生假象。本实验所介绍的实验步骤适用于分析3kb～5 kb的复制型的DNA 限制性片段。
【 仪器 、材料与 试剂 】
1.琼脂糖粉(Ⅱ型，MediumEEO，Sigma)。
2.TBE 贮存液(450mmol/L Tris-硼酸盐，10mmol/L EDTA)：1L 体积，54g Tris 碱(Fluka)，27.5g 硼酸(Fluka)，20mL 0.5mmol/LEDTA(pH8.0；Serva)，室温保存。
3.6×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝(Bio-Rad)0.25%，二甲苯青FF(Bio-Rad)，15%的Ficoll(400 型，pHarmacia)溶于水中，室温保存。
4.碱性缓冲液(40mmol/L NaOH 和1mmol/L EDTA)：1L 体积，8mL 5mol/LNaOH(Fluka)，2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0，Serva)，需新鲜配制。
5.EB 贮存液(10mg/mL)：1g EB(Sigma)，100mL 去离子水，避光容器4℃保存。
【实验步骤】
中性/中性双向凝胶电泳
第一向电泳：(低琼脂糖浓度和低电压)
1.用胶带封好一个胶模，将其放在一个水平的台面上(最好用水平仪检测过)。放入样品梳(梳齿底部与玻璃板之间距离为2mm)。
2.取适量的琼脂糖粉末和TBE 电泳缓冲液(0.4%琼脂糖，45mmol/Ltris-硼酸盐和1mmol/L 的EDTA)配制凝胶，加热时不时地轻摇玻璃瓶或锥形瓶，确保琼脂糖全部溶解。
3.冷却该溶液至60℃，然后倒入胶模中，让其在室温下静置凝固30min～1h。完全凝固后小心移去梳子和胶带，把胶板移至电泳槽内。
4.向电泳槽内注入相同的TBE 缓冲液(45mmol/Ltris-硼酸盐，1mmol/L 的EDTA)直至缓冲液刚好没过凝胶面。
5.取一定量的DNA 样品与6×上样缓冲液混合，注入缓冲液中加样孔内。盖上电泳槽，把电源连在电极上，让DNA 向正极泳动，电压为1V/cm(由两电极之间的距离测定)。
6.电泳24h 后，取出胶板。用TBE 缓冲液和0.3μg/mL EB 贮存液配成的染液染色。
7.紫外光下显色，并切下含有DNA 样品的胶带。
第二向电泳：(高琼脂糖浓度、高电压)
8.准备另外一个胶模，但不带梳子。把模子放在一个水平台面上(最好用水平仪检测过)，操作要在4℃冷室内进行。
9.制备好含有EB 的TBE 缓冲液(0.3μg/mL EB，45mmol/L Tris-硼酸盐，lmmol/LEDTA)并冷却至4℃。
10.按第一向电泳的方法，配制琼脂糖凝胶，只不过琼脂糖浓度为1.0%。
11.冷却琼脂糖凝胶溶液至约70℃，加入EB 至浓度为0.3μg/mL。
12.把第一向电泳中切下的样品凝胶带水平放置在第二个胶板的顶端，然后倒入含有1.0%琼脂糖凝胶溶液，并使之凝固(都在4℃下进行)。
13.移去胶带，并把胶板放到电泳槽内，向槽内注入冷却至4℃的含有0.3μg/mL EB的TBE 缓冲液，使缓冲液超过胶面约1mm。放置循环水泵的导管于电泳槽两极间缓冲液内，使电泳液在两极间循环。
14.盖上电泳槽并接好电源。DNA将向正极泳动。电压4V/cm，4℃下电泳14h，电泳结束后，将胶板从电泳槽内取出。如果DNA样品已被标记(如32P)可直接进行放射自显影。若样品没有被标记，可采用杂交的方法。放射自显影可在室温下进行，也可在-70℃下用增敏屏进行曝光。没有标记的样品可用Southern-杂交或碱性转移法将样品DNA转至尼龙膜上，用同位素标记探针杂交而进行检测。
中性/碱双向电泳
第一向电泳：中性/碱性双向电泳的第一向同中性/中性双向电泳的第一向电泳步骤几乎完全相同。
第二向电泳：(0.8%琼脂糖，NaOH-EDTA 缓冲液，电压1V/cm)
1.制备一个胶模不带梳子，并把它放于4℃冷室内的水平台面上(最好用水平仪测过)。
2.配制NaOH-EDTA 缓冲液(40mmol/L NaOH，1mmol/L EDTA)冷却到4℃。
3.把从第一向电泳中切下的样品带置于碱性缓冲液中，室温下平衡至少30min。之后将平衡好的样品带平行放置在胶模的一端，温度为4℃。
4.配制 琼脂 糖凝胶，浓度为0.8%。
5.将 琼脂 糖溶液冷却至60℃后，加入NaOH 和 EDTA 至浓度分别为40mmol/L 和1mmol/L，将配好的胶液倒入模子中，让样品带和胶在4℃下静置凝固。
6.去掉胶模上的胶带，把胶板放入电泳槽内。加入碱性缓冲液至超过胶面约1mm。把循环水泵导管置于两极间缓冲液中，并使缓冲液在电泳槽中循环。
7.盖上电泳槽，连好电源。DNA 分子将向正极泳动(红色接线柱)。电压1V/cm，4℃下至少24h。
8.中性/碱性双向电泳的样品检测基本相同于中性/中性双向电泳的方法。
【注意事项】
1.DNA 片段的大小对双向电泳条件的选择是一个关键因素，本实验所用例子为3kb～5kb。如果DNA 片段超过5kb，双向电泳的条件需要相应地改变。
2.加样量也是一个关键步骤，理想的加样量是300ng～1000ng。
3.第一向电泳中，凝胶的长度应至少达到25cm，才能保证更好地分离。0.4%的琼脂糖凝胶比较脆，取梳子时要格外小心。
4.TBE 浓度最初采用90mmol/L Tris-硼酸盐和2mmol/L EDTA 。但现在通常所用的浓度仅为其一半即可提供所需缓冲能力。
5.在整个中性/中性双向电泳过程中，要使用同一批TBE 贮存液，以保证相同的离子强度和pH。
6.在双向电泳过程中，可在样品一端加合适的DNA 分子量标记物，帮助分析样品的大小和位置。在第一、第二向中，该标记物都起重要作用，尤其是在第二向中，作用更大。

来源：实用分子生物学实验指南