方案9 第二向：蛋白质的 SDS-PAGE 实验

1.在 100°C 加热琼脂糖封闭溶液使之熔化。每块凝胶约需 1ml 溶液。完全熔化琼脂糖要花 1Omin，最好在即将平衡 IPG 胶条时进行（方案 8)。琼脂糖熔化后，将其冷却至 40~50°C。

2.在第二向凝胶表面的平板之间用钳子定位平衡后的 IPG 凝胶条，保证塑料支持条靠着其中一块玻璃平板。在平板之间用一把薄的软塑料尺子推动 IPG 胶条，直到 IPG 底边和凝胶表面紧密接触。从 IPG 胶条一端至另一端逐渐沿玻璃平板推动胶条。为了避免 IPG 胶条被撕破，应在凝胶的塑料支持面施力使 IPG 胶条放入适当位置。

保证在平板凝胶和 IPG 胶条底边之间，以及塑料支持和玻璃平板之间没有气泡。如果有气泡，轻压 IPG 胶条的塑料支持赶走气泡。如果气泡在第二. 向凝胶上方，不要过重地压 IPG 胶条表面，那样可能会使 SDS-PAGE 凝胶上表面的孔径缩小。

3.如果需要分子量标准，将准确剂量的分子量标准（对考马斯染色来说需 200~1OOOng; 对银染来说，需 10~50ng) 和已熔化的琼脂糖封闭溶液混合，吸取 15~20ul 此混合物至一小张滤纸上。

4.琼脂糖凝固后，将滤纸夹在两个玻璃平板之间，以便它在 IPG 胶条末端和平板凝胶上部相连接。

如果凝胶将用于印迹，用抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶或抗生物素蛋白-碱性磷酸酶作蛋白质检测，可使用生物素酰化标准。所使用的生物素酰化标准量见操作指导手册。

5.缓慢吸取溶化的琼脂糖封闭溶液至 IPG 胶条上，避免产生气泡。在继续下述步骤之前，琼脂糖应冷却并凝固至少 lmin。

在琼脂糖内包埋凝胶条是为了固定胶条使之处于正确位置，确保 IPG 胶条和凝胶之间的良好连接。

6.按操作指导手册，完成电泳装置的安装。连接冷却装置（如果有的话），使其保持凝胶温度在 10~15°C。

虽然冷却不是必需的，但这样可大大减少凝胶之间的变化，并允许凝胶在高电流下电泳，这样可减少电泳的时间。

建议标准和大型凝胶应冷却，冷却可大大提高凝胶之间的重复性，有助于减少人为的影响，例如凝胶的「微笑，，条带。如果在实验室中温度有大的波动，冷却就非常重要了。

7.按方案中表 7 或表 4.8 中建议的电泳条件来设置电泳仪，打开电源，开始电泳。

电泳分两步进行。第一步持续时间较短，使用低电流或低功率设置，使蛋白产生最初的迁移和堆积，在电泳开始 5~15 min 之后（见表 4.7 和表 4.8)，检查溴酚蓝是否已进人凝胶；第二步，电流或功率要升高以允许快速分离。

8.当溴酚蓝达到距凝胶底部 0.5~1cm 时，关掉电源，从电泳槽中将凝胶移出。

9.将凝胶水平放置，除去隔板，小心不要损坏凝胶，用塑料弹性刀片小心将每块凝胶的两块玻璃平板分开。不要用金属切片，因其会在玻璃板上留下划痕。凝胶应该贴于其中一面玻璃板。

10.立即进行凝胶的染色（方案 10~方案 14) 或蛋白质的转膜（方案 15~16 。

实验提示：切忌让凝胶干燥！如果必要，凝胶留在电泳槽中，继续完成下一步方案的准备工作。