方案5 胚胎移植实验

在研究发育的过程中，胚胎大脑的宫内细胞移植是非常有用的方法（Campbell et al.1995;Brustle et al.1995;FisheH 1995;Olsson et al.1997,1998a)。细胞可以通过手动注射移植到胚胎脑室中。使用更精密的仪器，如超声波辅助移植可以把细胞移植到受体胚胎的实质（Olssonetal.1997), 或神经管的空腔中（LiuetaL1998)。

宫内移植实验可以研究神经前体细胞在发育的特定阶段形成特定神经元类型的过程，以及局部环境在分化发育过程中所起的作用（如分化潜能)，为发育研究提供了独一无二的工具，宫内移植被用于前脑前体细胞移植实验，并与新生或成年受者的相关实验做出比较。研究者发现，妊娠中期胚胎端脑前体细胞异体移植至成年受者后，，移植细胞更倾向于分化形成在供者原位的细胞表型，而不是移植位点的细胞表型（Olsson et al.1995)。由于神经形成主要发生于出生前，成年和新生受者常缺乏引导前体细胞分化的一些具体环境，移植实验的结果表现出了很大的限制性。实际上，将妊娠中期的纹状体前体细胞通过宫内移植植入到相同时期胚胎受者的前脑脑室，可以清楚地发现这些前体细胞与之前所提到的植入成年或新生受者体内的前体细胞相比，有更高的分化潜 (Campbell et al.1995;Briistle et al.1995;Fishell 1995;Olsson et al.1997,1998a)。

移植到胚胎前脑脑室的前体细胞在发育大脑中的整合是不均匀的，所以，上述实验更倾向于验证不同区域对神经前体细胞分化的影响，而不是细胞在移植到不同区域后的分化能力。为了进一步证实神经前体细胞的分化情况，Olsson 等（1997) 利用高分辨率超声波反向散射显微镜（Tumbull et al.1995b), 建立了完备的超声波辅助宫内移植模式，以便于向 E12.5~13.5 小鼠胚胎中的发育区域进行实质内注射。这种超声波辅助胎注射技术也适用于向胚胎头褶刚刚闭合时（E9~9.5;LiuetaL1998) 的神经管空腔内注射细胞。

一、手动脑室内注射

在作者的实验室，已经成功地实施了 E15-20 宫内大鼠胚胎脑室注射。在发育的后续阶段，胚胎充满子宫，前脑变得更清晰，也更适合移植。

1.为了缩短实际的手术时间，细胞悬液和移植过程中需要的所有配置均需在孕鼠麻醉前预先准备好。

2.动物背面向下放置，腹部用 70% 乙醇消毒，做中线剖腹手术，用消毒巾覆盖。

3.整个实验过程要保持无菌，一次移出一个子宫角。在对移出的子宫角进行操作时，用光纤发出的透射光照射子宫囊，使端脑泡和颅缝变得清晰。这样，随着胚胎的优化导向，前脑脑室清晰可见。

4.实验助手固定住胚胎，实验者用装有玻璃微量加液器的 10ul Hamilton 射器手动注射。注射在数秒内完成，针头在停留 5~10s 后拔出。为了提高胚胎存活率，在注射过程中，尽量不要让羊水渗漏出来。在移植后，子宫角放回腹腔内，缝皮并等待母鼠分娩。

二、超声辅助下脑实质靶位点或早期胚胎神经管空腔注射

1.选择妊娠 9.5~13.5d 的孕小鼠，麻醉后腹部沾湿去毛，做 2 cm 中线切口。小心地单独取出每一个子宫角，准备在一侧注射。将子宫角重新放置在腹腔内，胚胎在卵巢侧，待注射的一侧向着腹腔外。手术台分两层，将孕鼠放在下层，在培养皿的底部打一个直径 25_的洞，用薄塑料膜封住洞口（图 14-10)。培养皿安装在手术台上层，正对孕鼠的腹部。包含着第一个待注射胚胎的那部分子宫从塑料薄膜的裂缝中轻轻拉出来（Olsson et al.1997;Liu et al.1998)。培养皿里盛有消毒的含有转镁氯化物的磷酸盐缓冲液，作为组织和传感器之间的流动相。微毛细管的尖端在超声图像显示上是一个亮点，把 UBM 信号（图像亮度）调大，实验者可以在操作视野内控制针尖的位置。

2.在 UBM 辅助下，调整胚胎的位置，获取冠状面或水平面超声波图像，以便于皮质内注射。为了便于向早期神经管腔隙内注射，一般采取矢状面图像。在确定了实质内靶位点 (作者曾成功地向 LGE、MGE、小脑原基、顶盖、大脑被盖部注射）或神经管腔的位置之后，玻璃微毛细管插入子宫壁，向靶位点注射 1~2ul 细胞悬液。细胞悬液的反向散射信号非常高，实验者可以看到注入的细胞悬液在实质靶位点中扩散，或填充于脑室的空隙中。在注射完一个胚胎后，从塑料薄膜的缝隙里轻轻抽出第二个胚胎，摆好位置准备注射，同时将第一个胚胎放回腹腔中。按照这种方法，可以在 30~60 min 内注射完一侧子宫角上的所有胚胎（4~10)。为了在下一步实验中辨别各个胚胎，每一个注射过的胚胎均需标记。在注射完毕后，将子宫角放回腹腔内，给动物缝皮。