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利用MUG检测 β-葡萄糖醛酸酶(GUS)

相关实验:报告基因实验

最新修订时间:

原理

报告基因是一个分子生物学概念,它是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且实验材料原本不会产生的性状的基因。作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:①已被克隆和全序列已测定;②表达产物在受体细胞中本不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;③其表达产物能进行定量测定。

材料与仪器

组织样品
GUS 缓冲液
离心机

步骤

一、完整组织的提取

1. 取少量(5~50 mg ) 叶片、根、愈伤等组织样品,所需样品量由材料决定。

2. 离心管中加入 GUS 缓冲液(50~200 ul),组织匀浆。

3. 16000 g,4℃ 离心 15 min,沉淀破碎的细胞。

4. 检测提取物的蛋白质浓度。

5. 用 GUS 缓冲液稀释提取物,使蛋白质总浓度为 0.1 mg/ ml。

6. 立即使用提取物,或者 -80℃ 保存。

二、原生质体制备

1. 通过离心(50 g,1 min),小份(1x106)收集转化的原生质体,用 2 ml 的 3 M 缓冲液重悬。

2. 取一份原生质体,用血细胞计数板计数。

3. 将剩余的原生质体 50 g 离心 1 min,用 150 ul 的 GUS 缓冲液重悬,短暂涡旋(或者通过 26 G 的抽吸),静置 5 min。

4. 离心(16000 g,4℃ 15  min ) ,使细胞碎片沉淀。检测提取物的蛋白质浓度,参照完整组织样品的方法对其进行稀释。

常见问题

本实验来源「麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南」〔英〕H.D.琼斯  P.R .休里 主编。

来源:丁香实验

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