材料与仪器
植物组织
裂解液 萤光素酶分析缓冲液
离心机
裂解液 萤光素酶分析缓冲液
离心机
步骤
一、完整组织
1. 液氮速冻植物组织（5~50 mg)，研磨成粉末状。
2. 100~400 ul 裂解液室温重悬，组织匀浆。
3. 16000 g，4℃ 离心 15 min，弃掉破碎的细胞。
4. 检测提取物中的蛋白质浓度。
5. 立即使用提取物，或者 -80℃ 保存。
二、原生质体
1. 50 g 离心 4 min，小份收集（1 x106 ) 原生质体。
2. 用 2 ml 的 3M 缓冲液重悬，50 g 离心 4 min。
3. 400 ul 裂解液重悬，短暂涡旋（或者通过 26G 的抽吸）。
4. 16000 g，4℃ 离心 15 min，沉淀破碎的细胞。检测提取物的蛋白质浓度。
三、萤光素酶的检测
1. 取 20 ul 分装的组织提取液于不透明的微型板，以未转化组织的提取物作对照。
2. 设置光度计程序，加入 100 ul 萤光素酶分析缓冲液，等待 2s，在 10s 内读出萤光素酶的活性值。反应的光强度接近常数的时间约为 1 min，然后慢慢衰减，半衰期大约 10 min。如果光是充足的，读数时间也会缩短。
3. 用荧光单位 flu /10 s/ mg 表示活性，或者参照提纯的 LUC ( 用来制作标准曲线）的表示方法。
4. 经常会使用第二种报告基因 （内参对照）如 GUS 进行瞬时表达分析，其检测结果再与对照报告基因的表达对比和进行标准化。需要注意的是，有报道说当植物组织用萤光素酶裂解液提取后，GUS 会被完全激活，但是GUS 缓冲液会影响到 LUC 的活性。第二点需要说明的是，对照载体既不会影响被检测载体的表达，也不会受到培养条件的影响。 一般而言，在基因枪转化或者电激转化前，通过以 1：10 的比例混合对照载体与被检测载体，使得对照载体的表达量保持在较低水平。另外要知道瞬时表达实验需要多次重复，以对数据的统计相关性进行分析。
1. 液氮速冻植物组织（5~50 mg)，研磨成粉末状。
2. 100~400 ul 裂解液室温重悬，组织匀浆。
3. 16000 g，4℃ 离心 15 min，弃掉破碎的细胞。
4. 检测提取物中的蛋白质浓度。
5. 立即使用提取物，或者 -80℃ 保存。
二、原生质体
1. 50 g 离心 4 min，小份收集（1 x106 ) 原生质体。
2. 用 2 ml 的 3M 缓冲液重悬，50 g 离心 4 min。
3. 400 ul 裂解液重悬，短暂涡旋（或者通过 26G 的抽吸）。
4. 16000 g，4℃ 离心 15 min，沉淀破碎的细胞。检测提取物的蛋白质浓度。
三、萤光素酶的检测
1. 取 20 ul 分装的组织提取液于不透明的微型板，以未转化组织的提取物作对照。
2. 设置光度计程序，加入 100 ul 萤光素酶分析缓冲液，等待 2s，在 10s 内读出萤光素酶的活性值。反应的光强度接近常数的时间约为 1 min，然后慢慢衰减，半衰期大约 10 min。如果光是充足的，读数时间也会缩短。
3. 用荧光单位 flu /10 s/ mg 表示活性，或者参照提纯的 LUC ( 用来制作标准曲线）的表示方法。
4. 经常会使用第二种报告基因 （内参对照）如 GUS 进行瞬时表达分析，其检测结果再与对照报告基因的表达对比和进行标准化。需要注意的是，有报道说当植物组织用萤光素酶裂解液提取后，GUS 会被完全激活，但是GUS 缓冲液会影响到 LUC 的活性。第二点需要说明的是，对照载体既不会影响被检测载体的表达，也不会受到培养条件的影响。 一般而言，在基因枪转化或者电激转化前，通过以 1：10 的比例混合对照载体与被检测载体，使得对照载体的表达量保持在较低水平。另外要知道瞬时表达实验需要多次重复，以对数据的统计相关性进行分析。
来源：丁香实验
