报告基因实验

实验分类：

植物学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

报告基因是一个分子生物学概念，它是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且实验材料原本不会产生的性状的基因。

作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：

（1）已被克隆和全序列已测定；

（2）表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；

（3）其表达产物能进行定量测定。

应用

报告基因实验可以用于以下几种研究：

（1）植物分子生物学研究；

（2）用以鉴别基因的表达模式；

（3）在获得稳定转化植株的过程中也可用作转化细胞的标记。

来源：丁香实验

操作方法

利用MUG检测 β-葡萄糖醛酸酶（GUS）

一、完整组织的提取1. 取少量（5~50 mg ) 叶片、根、愈伤等组织样品，所需样品量由材料决定。2. 离心管中加入 GUS 缓冲液（50~200 ul），组织匀浆。3. 16000 g，4℃ 离心 15 min，沉淀破碎的细胞。4. 检测提取物的蛋白质浓度。5. 用 GUS 缓冲液稀释提取物，使蛋白质总浓度为 0.1 mg/ ml。6. 立即使用提取物，或者 -80℃ 保存。二、原生质体制备1

MUG 荧光分析

1. 分别取 25 ul 和 50ul 组织提取物样品于 96 孔板中（黑色或者白色），包括未转化的对照组织，加 GUS 缓冲液至总体积为 200 ul，混匀。2. 加入 100 μl 含 2.5 mg/ml MUG（终浓度为 2 mmol/L ) 的 GUS 缓冲液以开始反应，混匀，加盖。3. 37℃ 温浴，反应 5~10 min。取 50 μl 反应液加入另一个含有 200 ul 0.2 mo

GUS 活性的组织化学检测

1. 将组织置于新配制的 HGUS 缓冲液中（含有 X-Gulc 及其他添加物），足以完全浸没材料，试验在微量滴定板或者试管中进行。2. 吸真空 5~10 min，然后去掉真空条件。3. 铝箔包裹，37℃ 放置 48 h。4. 用 100 mmol/L 的磷酸盐缓冲液（pH 为 7.0）洗脱材料。5. 为了清洗材料以便观察，在 25% 的乙醇溶液中孵育 15~30 min，在 50% 的乙醇溶液中

植物提取物中LUC活性的检测

一、完整组织1. 液氮速冻植物组织（5~50 mg)，研磨成粉末状。2. 100~400 ul 裂解液室温重悬，组织匀浆。3. 16000 g，4℃ 离心 15 min，弃掉破碎的细胞。4. 检测提取物中的蛋白质浓度。5. 立即使用提取物，或者 -80℃ 保存。二、原生质体1. 50 g 离心 4 min，小份收集（1 x106) 原生质体。2. 用 2 ml 的 3M 缓冲液重悬，50 g 离心

利用冷型 CCD 像机进行 LUC 的活体检测

对于萤光素酶的检测来说，需要解决荧光素渗透进入活体组织这一问题 [7]。多数情况下，用荧光素溶液简单地喷洒植物就可以解决，但是一些组织，如发育后期的种子不能吸收荧光素，需要产生伤口（见注 27 ) 以利于底物进入 [52, 53 ]。通过组织提取或者原位杂交的方法，植物中 LUC 活性的明显缺失应该很容易得到确定 [7, 54]。因为伤口会影响荧光素-O2 的动态平衡，即使是重复喷洒荧光素之后达

荧光蛋白（FP) 的显微检测

表达突光蛋白的材料一般首先用落射荧光显微镜（epi-fluorescent microscopy) 来观察，尤其当研究表皮上表达的荧光蛋白或者用反褶积软件去掉从焦点之外采集的荧光时[18]。然而，对于较厚的材料，必须使用共聚焦显微镜，因为它可以穿过产生荧光的样品，深入材料 50 um 或更厚的地方，从而产生很薄的（0.5~1.5 um ) 光切片。此外，如果对多种荧光蛋白成像，共聚焦显微镜也十

花青素表达的定量

1. 瞬时表达研究植物组织经基因枪转化培养大约 12 h 后，转化细胞开始表现出深红色或者偶尔为深蓝色的斑点。颜色常常会向整个液泡扩散，从外表上看整个细胞都是红色的。在几天时间里，颜色将会增强，并且能在 1~2 周内保持稳定。对于有些细胞来说，其深色液泡内含物中的花青素或者 AVI [ 27 ] 会隐退，或者随着时间的推移慢慢地沉积下来，在这种情况下个体转化细胞更难以判断。尽管大量的细胞积累花青素