材料与仪器
组织
溶液 H
尼龙网 匀浆器
溶液 H
尼龙网 匀浆器
步骤
组织制备
1. 切碎组织，用加 250 mmol/L 蔗糖的 H 溶液清洗组织/组织培养物：
溶液 H：
15 mmol/L PIPES，pH 7.2
80 mmol/L KCl
15 mmol/L NaCI
0.5 mmol/L 精咪
0.2 mmol/L 精胺
1 mmol/L DTT
1 mmol/L PMSF
细胞匀浆
2. 清洗后，在二倍体积的含 250 mmol/L 蔗糖的溶液 H 中机械破碎细胞。
纯化细胞核组分粗品
3. 将细胞匀浆粗品用几层（例如 4 层）溶液 H 浸透的 eheesecloth 或 120 μm 尼龙网过滤。
4. 过滤后，加入 6 倍体积含 2.3 mol/L，蔗糖的溶液 H（加入溶液的蔗糖终浓度为 1.62 mol/L，一共为 9 倍体积的含蔗糖的溶液 H），然后用 Sorvall SS34 转头在 15000 r/min 离心 30 分钟从稀释的滤液粗品中收集细胞核。
制备纯细胞核
5. 在一个带宽松结合（B）研杵的 Dounce 匀浆器中用 4 倍体积的含 1.0 mol/L 蔗糖的溶液 H 重悬浮细胞核沉淀粗品。
6. 重悬浮的沉淀中加 6 倍体积含 2.3 mol/L 蔗糖的溶液 H，充分混匀（加入的溶液中的蔗糖终浓度为 1.78 mol/L；总共为 10 倍体积的含蔗糖的溶液 H）。
7. 在每一离心管异质同晶聚合物超速离心管底部加入 4 ml 含 2.0 mol/L 蔗糖的溶液 H；上面加 34.5 ml 的重悬浮细胞核；用 Beckman SW27 或于与之对等的转头在 25000 r/min 离心 60 分钟。
用 DNA 酶Ⅰ处理纯化的细胞核
8. 离心后，用 0.25 倍体积的 0.1 mmol/L MgCl2，292 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 8.5 溶液重悬浮经过蔗糖分部梯度纯化的细胞核（细胞核终浓度以光吸收法测定为 100 A260单位/ml）。重悬浮后立刻再用 0.1 mmol/L MgCl2，292 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 8.5 溶液稀释到 20A260 单位/ml。
9. 进行第一次 DNA 消化，加入 DNA 酶Ⅰ至终浓度为 1 μg/ml，22℃ 消化 15 分钟。
10. 经 DNA 酶Ⅰ第一次消化后的细胞核悬浮液下面加 0.25 倍体积的 0.1 mmol/L MgCl2，876 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 7.5 溶液，用 Sorvall HB-4 悬桶式转头 11000 r/min 离心 10 分钟。
11. 用最小体积（例如，0.025 倍体积）的溶液 J 重悬浮细胞核沉淀。然后用溶液 J 稀释至终体积为用来进行第一次 DNA 酶Ⅰ消化所用体积的 1/5。
溶液 J：
0.1 mol/L MgCl2
292 mmol/L 蔗糖
10 mmol/L 三乙醇胺，pH 7.5
12. 加入 DNA 酶Ⅰ至终浓度为 5 μg/ml，22℃ 消化 15 分钟进行第二次 DNA 消化。
用非离子活化剂和 NaCl 抽提 DNA 酶Ⅰ处理的细胞核
13. 离心回收消化的细胞核：经 DNA 酶Ⅰ第二次消化后的细胞核悬浮液下面加等体积的 0.1 mmol/L MgCl2，876 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCI，pH 7.5 溶液，用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟。
14. 在得到的沉淀中加 0.225 倍体积的溶液 J，在匀浆器中用宽松结合的研杵 (B) 重悬浮细胞核。
15. 在重悬浮细胞核组分中加入 0.025 倍体积的 20% (w/v) Triton X-100 使其终浓度为 2% (w/v)，冰上孵育 10 分钟。
16. 下面不加其他溶液，用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟回收细胞核，用 0.25 倍体积的溶液 J 在 Dounce 匀浆器中用宽松结合的研杵（B）重悬浮含有经 DNA 酶 Ⅰ处理，非离子活化剂抽提过的细胞核的沉淀组分.
17. 在重悬浮细胞核中加入 0.25 倍体积的冷含 100 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 7.5 的 2 mol/L NaCl，使 NaCl 的终浓度为 1 mol/L，冰上孵育 10 分钟。
18. 用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟回收核膜孔复合物-核纤层，用最少体积（例如，0.25 倍体积）的溶液 J 重悬浮。
1. 切碎组织，用加 250 mmol/L 蔗糖的 H 溶液清洗组织/组织培养物：
溶液 H：
15 mmol/L PIPES，pH 7.2
80 mmol/L KCl
15 mmol/L NaCI
0.5 mmol/L 精咪
0.2 mmol/L 精胺
1 mmol/L DTT
1 mmol/L PMSF
细胞匀浆
2. 清洗后，在二倍体积的含 250 mmol/L 蔗糖的溶液 H 中机械破碎细胞。
纯化细胞核组分粗品
3. 将细胞匀浆粗品用几层（例如 4 层）溶液 H 浸透的 eheesecloth 或 120 μm 尼龙网过滤。
4. 过滤后，加入 6 倍体积含 2.3 mol/L，蔗糖的溶液 H（加入溶液的蔗糖终浓度为 1.62 mol/L，一共为 9 倍体积的含蔗糖的溶液 H），然后用 Sorvall SS34 转头在 15000 r/min 离心 30 分钟从稀释的滤液粗品中收集细胞核。
制备纯细胞核
5. 在一个带宽松结合（B）研杵的 Dounce 匀浆器中用 4 倍体积的含 1.0 mol/L 蔗糖的溶液 H 重悬浮细胞核沉淀粗品。
6. 重悬浮的沉淀中加 6 倍体积含 2.3 mol/L 蔗糖的溶液 H，充分混匀（加入的溶液中的蔗糖终浓度为 1.78 mol/L；总共为 10 倍体积的含蔗糖的溶液 H）。
7. 在每一离心管异质同晶聚合物超速离心管底部加入 4 ml 含 2.0 mol/L 蔗糖的溶液 H；上面加 34.5 ml 的重悬浮细胞核；用 Beckman SW27 或于与之对等的转头在 25000 r/min 离心 60 分钟。
用 DNA 酶Ⅰ处理纯化的细胞核
8. 离心后，用 0.25 倍体积的 0.1 mmol/L MgCl2，292 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 8.5 溶液重悬浮经过蔗糖分部梯度纯化的细胞核（细胞核终浓度以光吸收法测定为 100 A260单位/ml）。重悬浮后立刻再用 0.1 mmol/L MgCl2，292 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 8.5 溶液稀释到 20A260 单位/ml。
9. 进行第一次 DNA 消化，加入 DNA 酶Ⅰ至终浓度为 1 μg/ml，22℃ 消化 15 分钟。
10. 经 DNA 酶Ⅰ第一次消化后的细胞核悬浮液下面加 0.25 倍体积的 0.1 mmol/L MgCl2，876 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 7.5 溶液，用 Sorvall HB-4 悬桶式转头 11000 r/min 离心 10 分钟。
11. 用最小体积（例如，0.025 倍体积）的溶液 J 重悬浮细胞核沉淀。然后用溶液 J 稀释至终体积为用来进行第一次 DNA 酶Ⅰ消化所用体积的 1/5。
溶液 J：
0.1 mol/L MgCl2
292 mmol/L 蔗糖
10 mmol/L 三乙醇胺，pH 7.5
12. 加入 DNA 酶Ⅰ至终浓度为 5 μg/ml，22℃ 消化 15 分钟进行第二次 DNA 消化。
用非离子活化剂和 NaCl 抽提 DNA 酶Ⅰ处理的细胞核
13. 离心回收消化的细胞核：经 DNA 酶Ⅰ第二次消化后的细胞核悬浮液下面加等体积的 0.1 mmol/L MgCl2，876 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCI，pH 7.5 溶液，用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟。
14. 在得到的沉淀中加 0.225 倍体积的溶液 J，在匀浆器中用宽松结合的研杵 (B) 重悬浮细胞核。
15. 在重悬浮细胞核组分中加入 0.025 倍体积的 20% (w/v) Triton X-100 使其终浓度为 2% (w/v)，冰上孵育 10 分钟。
16. 下面不加其他溶液，用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟回收细胞核，用 0.25 倍体积的溶液 J 在 Dounce 匀浆器中用宽松结合的研杵（B）重悬浮含有经 DNA 酶 Ⅰ处理，非离子活化剂抽提过的细胞核的沉淀组分.
17. 在重悬浮细胞核中加入 0.25 倍体积的冷含 100 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 7.5 的 2 mol/L NaCl，使 NaCl 的终浓度为 1 mol/L，冰上孵育 10 分钟。
18. 用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟回收核膜孔复合物-核纤层，用最少体积（例如，0.25 倍体积）的溶液 J 重悬浮。
来源：丁香实验
