果蝇胚

果蝇胚
溶液 E
研杵 匀浆器

胚收集和制备

1. 可用任一种方法收集果蝇胚（Oregon R P2 或任何其他的野生系）。

制备匀浆

2. 直接在 9 倍体积的抽提缓冲液（溶液 E ) 中融化冻存胚。

溶液 E：

250 mmol/L 蔗糖

50 mmol/L NaCl

50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，( 25℃)

5 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L PMSF

1 mmol/L TPCK

2.5 mmol/L NEM

3. 胚完全融化后在带紧密结合研杵（A ) 的 Dounce 匀浆器中推捣 4 次使之破碎，用 4 层溶液 E 浸透的 120 μm 尼龙网过滤匀浆。

细胞核组分粗品的纯化

4. 过滤后，2000 g 离心匀浆 10 分钟。

5. 吸出上清，沉淀部分（含细胞核）重悬浮于 0.5 倍体积的溶液 E 中。

6. 再加 4.5 倍体积的溶液 E 稀释细胞核悬液，按上述方法（2000 g 10 分钟）离心。

7. 重复一次步骤 5 和 6（重悬浮、稀释、离心）。

细胞核的热稳定/核酸酶消化处理

8. 将最后一次 2000 g 离心后的细胞核用带宽松结合研杵（B ) 的 Dounce 匀浆器重悬浮于 0.5 倍体积的 20 mmol/L Tris-HCl  (pH 7.5)，5 mmol/L MgCl₂ 溶液中。

9. 再加 0.5 倍体积的上述溶液，然后加入终浓度分别为 8 μg/ml 和 10 μg/ml 的 RNA 酶 A 和 DNA 酶Ⅰ。

10. 将重悬浮后加核酸酶的细胞核在 37℃ 孵育 5 分钟。

用非离子活化剂和 NaCI 抽提热稳定的、核酸酶处理过的细胞核

11. 2000 g 离心 10 分钟回收热稳定和核酸酶消化的细胞核。

12. 向沉淀中（含热稳定的核酸酶处理的细胞核）加入 0.9 倍体积的溶液 F，用带宽松结合研杵（B ) 的匀浆器重悬浮。

溶液 F：

292 mmol/L 蔗糖

10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)

0.1 mmol/L MgCl₂

13. 加 0.1 倍体积的 20% (w/v) Triton X-100 到细胞核悬液中，使 Tnton X-100 的终浓度为 2% (w/V)，冰上孵育 10 分钟。

14. 将经过热稳定，核酸酶处理，非离子活化剂抽提的细胞核在 2000 g 离心 10 分钟。

15. 用带宽松结合研件（B ) 的 Dounce 匀浆器将含有热稳定的，核酸酶处理和非离子活化剂抽提过的细胞核的沉淀组份重悬浮于 0.45 倍体积的溶液 F 中。

16. 加 0.05 倍体积的 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，然后加 0.5 倍体积的 2 mol/L NaCl，使 NaCl 终浓度为 1 mol/L，将悬液在冰上孵育 10 分钟。

17. 10000 g 离心 10 分钟回收不溶复合物，重悬浮沉淀，像 15 和 16 步中那样再次用 NaCI 抽提。

18. 10000 g 离心 10 分钟将核基质-核膜孔复合物-核纤层组份收集于沉淀组分中，用溶液 F 重悬浮。