爪蟾卵母细胞

卵巢
NaCl KCl MgSO4 Ca（NO3）2 CaCl2 NaHCO3 苯青霉素 硫酸链霉素 Na-HEPES
培养皿

卵母细胞收集和制备

1. 从成熟的雌性非洲爪蟾取整个或部分卵巢，在含 88 mmol/L NaCl，1 mmol/L KCl，0.9 mmol/L MgSO₄，0.33 mmol/L Ca（NO₃）₂，0.41 mmol/L  CaCl₂，2.4 mmol/L NaHCO₃，10 μg/ml 苯青霉素，10 μg/ml 硫酸链霉素和 10 mmol/L Na-HEPES，pH 7.6 的溶液中 18℃ 保存 2 到 4 小时。

2. 作好准备后，将卵巢组织移至一含少量溶液 L 的硅化过的培养皿中。

溶液 L：

83 mmol/L KCl

17 mmol/L NaCl

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2

细胞核和核膜的手工分离

3. 在溶液 L 中用 5^# 修表镊子挑取黑色半球和白色半球之间的过渡带中的单个卵黄卵母细胞。

4. 再用另一把 5^# 镊子夹住皱褶，两把镊子向相反方向用力将卵母细胞撕开。

5. 用镊子将细胞核从卵浆质中分出来，在溶液 L 中用一口径 0.7~0.8 mmol/L 的吸头反复吹吸 3 到 6 次清洗细胞核。

6. 最后再用新鲜的溶液 L 清洗一次细胞核并转移至一含有溶液 M 的硅化过的试管中。

溶液 M：

83 mmol/L KCl

17 mmol/L NaCl

10 mmol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2

7. 用一 0.3~0.4 mm 口径的吸头吹打细胞核。

8. 将没有核质的核被膜物质转移至一硅化的试管中，用溶液 L 反复吹打清洗，然后用尽量少体积的溶液 L 将其移至一 1.5 mI 的 Eppendorf 管中。

9. 汇合从 20~100 个细胞核中收集核被膜后在 8000 g 离心 4 分钟进行收集。

用 Triton X-100 和 1 mol/L KCl 抽提清洗过的核被膜

10. 为了制备富含爪蟾卵母细胞核纤层和核膜孔复合物的组分，将来自 50 个细胞核的核被膜用 300 μl 的 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，1 mol/L KCl 和 1% Triton X-100 溶液重悬浮；室温孵育 20 分钟；然后在 8000 g 离心 4 分钟收集盐和非离子活化剂抽提的核被膜。

11. 弃去上清，用 300 μl 的 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4）溶液重悬沉淀，再次在 8000 g 离心 4 分钟以清洗沉淀。用 10 mmol/L Tris-HCl 重悬浮清洗过的核膜孔复合物-核纤层组分。