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组织培养细胞染色体制备

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组织细胞用于遗传学分析最常见的是体外培养的细胞株,多为恶性肿瘤细胞株,且呈贴壁生长,仅小数细胞株为悬浮生长。培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和染色体标本制出清晰度高等优点。组织细胞染色体制备的关键是掌握好体外细胞的生长动态,只有处在对数生长期的细胞才能出现较高的分裂相,所以积水仙素处理的时机及量是染色体标本形态及分裂指数的关键。
  1、 实验材料
  培养液(PRMI 1640、M199、DMEM等),小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素,刻度 离心管 ,直吸管及弯头吸管,培养瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片。
  2、 培养液配制
  培养液 85-95%
  小牛血清 5-15%
  双抗(选择) 100u/ml
  3、 操作过程
(1)培养细胞:选择处于指数生长期、用大瓶培养的80-90%汇合单层培养细胞;
(2)终止培养:当有大量圆形发亮细胞出现时,加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培养混合液,置温箱继续培养6-10小时以抑制分裂期细胞停止于分裂中期;(3)聚集细胞:
  (A) 摇动法:
  可利用分裂中期细胞变圆与底物附着不牢特点,此时可持培养瓶,左右反复横向水平摇动,可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落;
  (B) 消化法:
  将培养液倒入 离心管 内,给培养瓶内加0.025%胰 蛋白酶 液0.5-1ml/瓶,水平左右摇动,便培养瓶底壁面完全接触消化酶,稍后用弯头吸管吹打,待细胞完全脱落后,加入3-5ml前培养终止消化。用吸管移入装有培养液的 离心管 内2000rpm10分钟。弃上清液,留沉淀细胞;
(4)低渗处理:给沉淀细胞加顶温的37℃0.075MKCL8ml左右,用吸管打均匀,在温箱中静置20-30分钟;
(5)预固定:向低渗处理适当的 离心管 中加新鲜配制的3∶2甲醇,冰乙醇固定液1-2ml,用 吸管 轻松吹打调匀,此措施能起到使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成块。
(6)固定:800-1000rpm10分钟,弃上清液加新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml,加入时要沿管壁慢慢加入,后轻轻吹打,封口后室温静置30分钟以上,反复三次;
(7)制片:末次离心后,倒掉上清液,留沉淀细胞,加新鲜配制固定液0.5ml左右,混匀后冰片制片,其它同外周血方法。
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