组织培养细胞染色体制备方法

组织细胞用于遗传学分析最常见的是体外培养的细胞株，多为恶性肿瘤细胞株，且呈贴壁生长，仅小数细胞株为悬浮生长。培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和染色体标本制出清晰度高等优点。组织细胞染色体制备的关键是掌握好体外细胞的生长动态，只有处在对数生长期的细胞才能出现较高的分裂相，所以积水仙素处理的时机及量是染色体标本形态及分裂指数的关键。
　　1、 实验材料
　　培养液（PRMI 1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度离心管，直吸管及弯头吸管，培养瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片。
　　2、 培养液配制
　　培养液 85-95%
　　小牛血清 5-15%
　　双抗（选择） 100u/ml
　　3、 操作过程
（1）培养细胞：选择处于指数生长期、用大瓶培养的80-90%汇合单层培养细胞；
（2）终止培养：当有大量圆形发亮细胞出现时，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培养混合液，置温箱继续培养6-10小时以抑制分裂期细胞停止于分裂中期；（3）聚集细胞：
　　（A） 摇动法：
　　可利用分裂中期细胞变圆与底物附着不牢特点，此时可持培养瓶，左右反复横向水平摇动，可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落；
　　（B） 消化法：
　　将培养液倒入离心管内，给培养瓶内加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶，水平左右摇动，便培养瓶底壁面完全接触消化酶，稍后用弯头吸管吹打，待细胞完全脱落后，加入3-5ml前培养终止消化。用吸管移入装有培养液的离心管内2000rpm10分钟。弃上清液，留沉淀细胞；
（4）低渗处理：给沉淀细胞加顶温的37℃0.075MKCL8ml左右，用吸管打均匀，在温箱中静置20-30分钟；
（5）预固定：向低渗处理适当的离心管中加新鲜配制的3∶2甲醇，冰乙醇固定液1-2ml，用吸管轻松吹打调匀，此措施能起到使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。
（6）固定：800-1000rpm10分钟，弃上清液加新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml，加入时要沿管壁慢慢加入，后轻轻吹打，封口后室温静置30分钟以上，反复三次；
（7）制片：末次离心后，倒掉上清液，留沉淀细胞，加新鲜配制固定液0.5ml左右，混匀后冰片制片，其它同外周血方法。