原理
本方法是由 Marelli-Berg 等 [ 2000 ] 的方法改写的。
材料与仪器
小鼠心脏 胶原蛋白酶A 无关对照抗体 大鼠抗小鼠内皮糖蛋白（endoglin)(CD105)抗体 山羊抗大鼠IgG微珠
MCEC生长培养液 非内皮细胞培养液 HBSS PS HHSS FB CMF 胰蛋白酶和EDTA混合液 FBS
细胞滤器 Petri培养皿 IS MACs柱
MCEC生长培养液 非内皮细胞培养液 HBSS PS HHSS FB CMF 胰蛋白酶和EDTA混合液 FBS
细胞滤器 Petri培养皿 IS MACs柱
步骤
1. 将心脏放入盛有约 5 ml HBSS/PS（HBSS，添加 150 U/ml 青霉素和 150 μg/ml 链霉素） 的 Petri 培养皿。
2. 除去主动脉和肺动脉等与心脏相连的血管。
3. 将心脏（小鼠心脏：放入含有 300 U/ml 青霉素和链霉素混合液、50 μg/ml 庆大霉素的 HBSS/PSG）切成两半，取出较大的血块和掉落的结缔组织。
4. 将心脏放入盛有 CMF （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS，添加 150 U/ml 青霉素和 150 μg/ml 链霉素胰蛋白酶和 EDTA 混合液（如Sigma））的 Petri 培养皿，冲洗后换人新鲜 CMF 。
5. 用手术刀将培养皿中的标木切成小块。
6. 将组织块悬起，再让其沉下，由此用 CMF 洗组织块。
7. 用手术刀片取组织块，然后移入盛有 10 ml 现配制的温胶原蛋内酶 A （胶原蛋白酶A : 是从溶组织梭状芽孢杆菌提纯的（103586，Roche）。1 mg/ml，用 HBSS 配制 10 ml。用时现配，过滤灭菌）（1 mg/ml）的容器。
8. 在 37°C 条件下孵育 30 min，同时搅动组织块。
9. 加入 CMF。
10. 摇动组织块，然后让其沉下，由此分散细胞。将细胞悬液移人试管。
11. 重复步骤 9 和步骤 10 几次。
12. 将细胞悬液离心（300 g，8 min）。
13. 轻轻吸去上清液，避免搅动细胞。
14. 用 5 ml 胰蛋白酶和 EDTA 混合液将细胞混悬，通过用吸管吹打将成团的细胞分散，然后在 37°C 条件下孵育 10 min。
15. 将 10 ml 含 1 % FS 的 HBSS/FB 加入已消化的组织和细胞，用孔径为 70 μm 的细胞滤器过滤。 .
16. 用 20 ml 冷 HBSS/FB 冲洗细胞滤器内的组织。
17. 将滤液中的细胞离心（300 g，8 min）。
18. 轻轻吸去上清液，保留细胞。
19. 加入约 5 μg 无相关抗体（如 OKT4/OKT8），轻弹试管以分散细胞。在冰上孵育 20 min，阻断 Fc 受体。
20. 加入 5 μg 大鼠抗小鼠内皮糖蛋白（endoglin）抗体（克隆 MY7/18），轻弹试管，在 4°C 条件下孵育 20 min。
21. 加入 30 ml HBSS，在 4°C 条件下离心（300 g，8 min）。
22. 加入 50 μl 山羊抗大鼠免疫微珠（用 20 μl HBSS 配制）。
23. 在 4°C 条件下孵育 15 min。
24. 加入 30 mlHBSS，洗免疫微珠，然后在 4°C 条件下离心（300 g，8min）。
25. 按照生产厂家的说明，将 MidiMacs 柱放在磁体上，用 500 μl 含有 1 % FCS 的 HBSS 洗 MidiMacs 柱。
26. 将 3 ml 含有 1 % FBCS 的 HBSS 加入试管，然后将微珠悬液加入 MidiMacs 柱。
27. 用 1 ml HBSS/FB 洗 3 次，随后用 500 μl 生长培养液洗。
28. 取出 MidiMacs 柱，放入 15 ml 试管，然后加入 4 ml MCEC 生长培养液（MCEC 生长培养液：含有 25 mmol/L 葡萄糖和 4 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM，添加 10 % FBS、150 U/ml 青霉素、150 μg/ml 链霉素和从牛脑提纯的内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS））。放入柱塞，收集结合于微珠的细胞。将细胞悬液移人明胶预涂的 25 cm2 培养瓶。
29. 为了保存非内皮细胞，将 MidiMacs 柱的洗液离心，接种于 25 cm2 培养瓶，用添加 15 % FBS 的 DMEM （含有 1000 mg 葡萄糖）培养。
维持培养
30. 每周换培养液 2 次。如果细胞单层 <50 % 时半换液。如果细胞单层达 50 %~ 80 % 时，全部换液。
31. 细胞单层达 80 % 时，用胰蛋白酶和 EDTA 混合液消化后按 1 : 3 传代。
32. 不要用超过 3 代的细胞。
2. 除去主动脉和肺动脉等与心脏相连的血管。
3. 将心脏（小鼠心脏：放入含有 300 U/ml 青霉素和链霉素混合液、50 μg/ml 庆大霉素的 HBSS/PSG）切成两半，取出较大的血块和掉落的结缔组织。
4. 将心脏放入盛有 CMF （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS，添加 150 U/ml 青霉素和 150 μg/ml 链霉素胰蛋白酶和 EDTA 混合液（如Sigma））的 Petri 培养皿，冲洗后换人新鲜 CMF 。
5. 用手术刀将培养皿中的标木切成小块。
6. 将组织块悬起，再让其沉下，由此用 CMF 洗组织块。
7. 用手术刀片取组织块，然后移入盛有 10 ml 现配制的温胶原蛋内酶 A （胶原蛋白酶A : 是从溶组织梭状芽孢杆菌提纯的（103586，Roche）。1 mg/ml，用 HBSS 配制 10 ml。用时现配，过滤灭菌）（1 mg/ml）的容器。
8. 在 37°C 条件下孵育 30 min，同时搅动组织块。
9. 加入 CMF。
10. 摇动组织块，然后让其沉下，由此分散细胞。将细胞悬液移人试管。
11. 重复步骤 9 和步骤 10 几次。
12. 将细胞悬液离心（300 g，8 min）。
13. 轻轻吸去上清液，避免搅动细胞。
14. 用 5 ml 胰蛋白酶和 EDTA 混合液将细胞混悬，通过用吸管吹打将成团的细胞分散，然后在 37°C 条件下孵育 10 min。
15. 将 10 ml 含 1 % FS 的 HBSS/FB 加入已消化的组织和细胞，用孔径为 70 μm 的细胞滤器过滤。 .
16. 用 20 ml 冷 HBSS/FB 冲洗细胞滤器内的组织。
17. 将滤液中的细胞离心（300 g，8 min）。
18. 轻轻吸去上清液，保留细胞。
19. 加入约 5 μg 无相关抗体（如 OKT4/OKT8），轻弹试管以分散细胞。在冰上孵育 20 min，阻断 Fc 受体。
20. 加入 5 μg 大鼠抗小鼠内皮糖蛋白（endoglin）抗体（克隆 MY7/18），轻弹试管，在 4°C 条件下孵育 20 min。
21. 加入 30 ml HBSS，在 4°C 条件下离心（300 g，8 min）。
22. 加入 50 μl 山羊抗大鼠免疫微珠（用 20 μl HBSS 配制）。
23. 在 4°C 条件下孵育 15 min。
24. 加入 30 mlHBSS，洗免疫微珠，然后在 4°C 条件下离心（300 g，8min）。
25. 按照生产厂家的说明，将 MidiMacs 柱放在磁体上，用 500 μl 含有 1 % FCS 的 HBSS 洗 MidiMacs 柱。
26. 将 3 ml 含有 1 % FBCS 的 HBSS 加入试管，然后将微珠悬液加入 MidiMacs 柱。
27. 用 1 ml HBSS/FB 洗 3 次，随后用 500 μl 生长培养液洗。
28. 取出 MidiMacs 柱，放入 15 ml 试管，然后加入 4 ml MCEC 生长培养液（MCEC 生长培养液：含有 25 mmol/L 葡萄糖和 4 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM，添加 10 % FBS、150 U/ml 青霉素、150 μg/ml 链霉素和从牛脑提纯的内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS））。放入柱塞，收集结合于微珠的细胞。将细胞悬液移人明胶预涂的 25 cm2 培养瓶。
29. 为了保存非内皮细胞，将 MidiMacs 柱的洗液离心，接种于 25 cm2 培养瓶，用添加 15 % FBS 的 DMEM （含有 1000 mg 葡萄糖）培养。
维持培养
30. 每周换培养液 2 次。如果细胞单层 <50 % 时半换液。如果细胞单层达 50 %~ 80 % 时，全部换液。
31. 细胞单层达 80 % 时，用胰蛋白酶和 EDTA 混合液消化后按 1 : 3 传代。
32. 不要用超过 3 代的细胞。
来源：丁香实验
