原理
组织切碎后于胰蛋白酶中搅拌数小时，每隔半小时收集已分离的细胞，离心后加入含血清的培养基。
材料与仪器
组织 DBSS 粗制胰蛋白酶 D-PBSA
生长培养基 皮氏平皿
培养瓶 离心管 瓶子 磁力搅拌机 镊子 移液管 血球计数仪
生长培养基 皮氏平皿
培养瓶 离心管 瓶子 磁力搅拌机 镊子 移液管 血球计数仪
步骤
1. 将组织（1~5 g）移入加有新配制的无菌 DBSS （50 ml）的皮氏培养皿中，清洗。
2. 转人第 2 个培养皿中，切除多余组织如脂肪或坏死组织，再转移至第三个培养皿中。
3. 用手术刀交叉切成约 3 mm3 小块。
4. 用弯头镊将组织移人预先称重的离心管或容器（预称重的50 ml 离心管两个，或常规容器两个）内。
5. 让组织块沉降。
6. 用 DBSS 重悬清洗组织块，使组织块沉降，去除上清液，如此重复 2 次以上。
7. 将离心管或容器再次称重。
8. 将所有组织块转入一个空的胰蛋白酶（2.5 %粗制胰蛋白酶，用 D-PBSA 或正常生理盐水配制）消化瓶中，用 D- PBSA （200 ml）冲洗容器或离心管。
9. 去除多余的液体，再加人 180 ml 的 PBSA。
10. 加入 20 ml 2. 5% 的胰蛋白酶（若需要也可加入其他酶包括胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶）。
11. 在锥形瓶（胰蛋白酶消化用瓶子，250 ml 锥形瓶或搅拌瓶）内加入搅拌子（于试管中高压消毒）。
12. 封住锥形瓶，放于搅拌器上，在温箱或温室内于 37°C 搅拌。
13. 每分钟大约 100 转，37°C 搅拌 30 min 。
14. 30 min 后，收集解离的细胞：
(a)使组织块沉淀。
(b)吸出上清液放入离心管中，放于冰上。
(c)向锥形瓶中加入新的胰蛋白酶溶液消化剩余的组织块，继续搅拌并孵育 30 min 。
(d)将步骤 14b 的细胞悬液以 500 g 离心 5 min ，以收集细胞。
(e)用 10 ml 含血清培养基重悬细胞闭，储存于冰浴。
15. 重复步骤 14 的过程直至组织块完全消化或已看不出进一步消化的迹象（大约3~4 h )。
16. 收集冷藏的细胞悬液，用血球计数板或电子记数仪计数细胞，检査细胞活性。
17. 细胞群体为异源性，由于校准口径较闲难，最初使用电子计数仪时需要用血球汁数板来确认。
18. 用无菌棉布或自制的筛网过滤，去除大的聚集物。
19. 将细胞悬液用生长培养基（含血清的生长培养基（如：DMEM/F 12 加10%胎牛血清））稀释，使每毫升培养基含有 1×106 个细胞。接种于培养瓶中，大约每平方厘米为 2×105 个细胞。当存活率不明确或难以预知时，细胞计数意义不大（如肿瘤活检时，死亡细胞的比例很高）。在这种悄况下，建议按每毫升 5~25 mg 组织的浓度接种。
20. 每隔一段时间更换一次培养基（2~4 天，以 pH 下降为标准）。由于部分细胞黏附较慢甚至易于悬浮生长，所以丟弃上清液前要先检查上清液中是否含有存活细胞。
2. 转人第 2 个培养皿中，切除多余组织如脂肪或坏死组织，再转移至第三个培养皿中。
3. 用手术刀交叉切成约 3 mm3 小块。
4. 用弯头镊将组织移人预先称重的离心管或容器（预称重的50 ml 离心管两个，或常规容器两个）内。
5. 让组织块沉降。
6. 用 DBSS 重悬清洗组织块，使组织块沉降，去除上清液，如此重复 2 次以上。
7. 将离心管或容器再次称重。
8. 将所有组织块转入一个空的胰蛋白酶（2.5 %粗制胰蛋白酶，用 D-PBSA 或正常生理盐水配制）消化瓶中，用 D- PBSA （200 ml）冲洗容器或离心管。
9. 去除多余的液体，再加人 180 ml 的 PBSA。
10. 加入 20 ml 2. 5% 的胰蛋白酶（若需要也可加入其他酶包括胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶）。
11. 在锥形瓶（胰蛋白酶消化用瓶子，250 ml 锥形瓶或搅拌瓶）内加入搅拌子（于试管中高压消毒）。
12. 封住锥形瓶，放于搅拌器上，在温箱或温室内于 37°C 搅拌。
13. 每分钟大约 100 转，37°C 搅拌 30 min 。
14. 30 min 后，收集解离的细胞：
(a)使组织块沉淀。
(b)吸出上清液放入离心管中，放于冰上。
(c)向锥形瓶中加入新的胰蛋白酶溶液消化剩余的组织块，继续搅拌并孵育 30 min 。
(d)将步骤 14b 的细胞悬液以 500 g 离心 5 min ，以收集细胞。
(e)用 10 ml 含血清培养基重悬细胞闭，储存于冰浴。
15. 重复步骤 14 的过程直至组织块完全消化或已看不出进一步消化的迹象（大约3~4 h )。
16. 收集冷藏的细胞悬液，用血球计数板或电子记数仪计数细胞，检査细胞活性。
17. 细胞群体为异源性，由于校准口径较闲难，最初使用电子计数仪时需要用血球汁数板来确认。
18. 用无菌棉布或自制的筛网过滤，去除大的聚集物。
19. 将细胞悬液用生长培养基（含血清的生长培养基（如：DMEM/F 12 加10%胎牛血清））稀释，使每毫升培养基含有 1×106 个细胞。接种于培养瓶中，大约每平方厘米为 2×105 个细胞。当存活率不明确或难以预知时，细胞计数意义不大（如肿瘤活检时，死亡细胞的比例很高）。在这种悄况下，建议按每毫升 5~25 mg 组织的浓度接种。
20. 每隔一段时间更换一次培养基（2~4 天，以 pH 下降为标准）。由于部分细胞黏附较慢甚至易于悬浮生长，所以丟弃上清液前要先检查上清液中是否含有存活细胞。
来源：丁香实验
