细胞冻存实验

细胞生长至对数晚期，以培养基制备高浓度细胞悬液，加入细胞保护剂，等份转移至冻存管中，缓慢冷冻。细胞冻存时向培养基中加入保护剂，即终浓度 5%。

15% 的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用 “慢冻快融” 的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为 -1 到 -2 ℃/min，当温度低于 -25 ℃ 时可加速，到 -80 ℃ 之后可直接投入液氮内（-196 ℃）。

细胞生长至对数晚期，以培养基制备高浓度细胞悬液，加入细胞保护剂，等份转移至冻存管中，缓慢冷冻。

细胞冻存时向培养基中加入保护剂，即终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。

细胞胰蛋白、BSS、DMSO、吸管、离心管

玻璃安瓿、酒精灯、线绳

纱布口袋、搪瓷罐

1. 肉眼及显微镜观察，确保细胞满足冷冻标准。

2. 使细胞生长至对数生长晚期，若为贴壁细胞，用胰酶消化，并进行细胞技数。若为悬浮生长细胞，进行细胞计数并离心。

3. 悬浮细胞的浓度为：2×10⁶ 个~2×10⁷ 个细胞 /ml。

4. 将以下任意一种细胞保护剂加入到生长培养基中，配制冻存液：

（a） 加 10%~20% 的二甲基亚砜（DMSO）或（b）加 20%~30% 甘油。

5. 用冻存液将细胞悬液按 1:1 的比例稀释至细胞度浓约为 1×10⁶~1×10⁷ /ml , 此时 DMSO 的浓度为 5%~10%（或甘油浓度为 10~15%）。建议勿将冻存管置于冰上，减少细胞退化。使用 DMSO 时，室温操作 30 min 是无害的，当使用甘油时，则对细胞是有益的。

6. 将细胞悬液分装至预先标记好的冻存管中，盖上盖子，拧紧，密封，注意不要太紧，避免螺旋扭曲变形。

7. 将冻存管夹在铝条上，装入储存筒中，或将其松散地排列在抽屉储存器中。

8. 将冻存管通过上述方法之一以 1 ℃/min 的速率进行冷冻。使用隔热保温的方法，使冻存管达到 - 70℃，若最初温度为 20℃，则需 4~6 h，但最好于 -70 ℃ 过夜。

9. 当冻存管温度达到 -70 ℃ 或更低时，在将其从 -70 ℃ 或能控制冷冻速率的冷冻柜中转移出来之前，检查冷冻记录，确定液氮罐中存放冻存管的合适位置。

10. 将冻存管转移至液氮冷冻罐中，最好不要使其浸没在液氮中，将放油冻存管的铝条和纸质管放入预先确定的储存筒中，或将个别冻存管放入预先确定的抽屉中。该步骤必须迅速（＜ 2 min），因为冻存管会以越 10 ℃/min 的速度升温，如果温度上升超过 -50 ℃，细胞会迅速恶化。

1. 二甲基亚砜能穿透许多合成的或天然的膜，包括皮肤和橡胶手套。因此，应谨慎处理。

2. 将冻存管放入液氮时，必须使用保护性手套和面罩。

3. 为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。

4. 冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为 -1℃~-1℃/分钟，当温度下降达 -25 ℃ 时，下降速度可增至 -5~-10 ℃/分钟，到 -100 ℃ 时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。

5. 初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。

6. 各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，骨髓干细胞 -2~-3 ℃/分钟合适；胚胎细胞耐受性较小，不宜太快。总之在一开始时，下降速度不能超过 -10 ℃/分钟。

7. 用什么防护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养细胞用 DMSO 较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在 20%~30% 甘油中很好。

8. 原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。

1. 为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。

2. 冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。

3. 初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。

4. 各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，骨髓干细胞－2~－3℃/分钟合适；胚胎细胞耐受性较小，不宜太快。总之在一开始时，下降速度不能超过－10℃/分钟。

5. 用什么防护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养细胞用DMSO 较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在20%-30%甘油中很好。

6. 原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。