实验秘笈 | 细胞冻存与复苏

培养细胞的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费；而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化，并随着传代次数的増加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。

现在细胞低温冷冻储存已成为细胞培养室的常规工作和通用技术。细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存

A、【概述】

冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。

首先细胞脱水使局部电解质浓度増高，pH 值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细胞内结构成份的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。

胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内 DNA 也是冷冻时细胞易受损伤部分，如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成 DNA 的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。

在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。

目前多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂。这两种物质对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

B、【用品】

（1）0.25% 胰蛋白酶

（2） 含 10%~20% 血清培养液

（3）DMSO（分析纯） 或无色新鲜甘油 （15 磅蒸汽高压消毒）

（4） 吸管、离心管、2 ml 安瓿 （或冻存管）

（5） 喷灯 （或其它安瓿封口设备）

C、【步骤】

（1） 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

（2） 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3） 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液 （含 10% DMSO 或甘油），冻存液中细胞的最终密度为 5×106/ml~1×107/ml.用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌安瓿中，每安瓿或冻存管加液 1~1.5 ml。

（4） 用火焰将安瓿熔封。熔封时必须保证安瓿完全封闭，同时注意不能使安瓿内细胞悬液的温度升高。安瓿上应写明细胞的名称。装入已做标记的小袋或支架同时作好记录。

（5） 封好的安瓿即可直接冻存。标准的冻存程序为降温速率- l~- 2℃/min 当温度达-25℃ 以下时，可増至- 5~- 10℃/min；到-100℃ 时，则可迅速浸入液氮中。

要适当掌握降温速度，过快会影响细胞内水份透出，太慢则促进冰晶形成。各种细胞对冷冻的耐受性不同，一般来讲上皮细胞和成纤维细胞耐受性大；骨髓细胞差一些，以- 2~- 3 ℃/min 合适；而胚胎细胞耐受性最小。

总之，在开始时温度下降速度不能超过- 10℃/min。要精确控制冷冻速度需要细胞冻存器，如无此设备一般可以采用以下几种冻存方法来控制冷冻速率。

①首先将安瓿直立放置于塑料盒或小纸盒中，周围固定，以免倾倒，因为安瓿颈口部一般较薄，冻存时易被膨胀的冰挤破。将安置好的小盒放入- 70℃ 冰箱中，经过 3 h 以后，取出安瓿移入液氮容器内。在放入液氮时，要戴手套操作以免冻伤。

②可以将标记好并装入安瓿的小袋或支架，从液氮容器口缓缓放入，按 1℃/min 的降温速度，在 30~40 min 时间内使其到达液氮表面。再停 30 min 后，直接投入液氮中。

现在冻存细胞除用安瓿外，常用的还有一种特制的塑料螺口小瓶，使用方便而且不会炸裂，但如质量不好，有时密封不严，因而使用前要仔细检查。

细胞冻存后，留在液氮容器外的系线要做好标记并做到沿着罐口顺序摆放，以免互相缠绕拿取不方便。液氮数量要定期检查，如发现液氮挥发一半时要及时补充。补加液氮时要做好眼、手、脚等身体暴露部位的防护以免冻伤。

细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。

（细胞冻存与复苏步骤）

细胞的复苏

A、【概述】

复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。

B、【用品】

培养液，吸管，离心管，培养瓶，带盖搪瓷罐。

C、【步骤】

（1） 从保存安瓿的小袋内或支架上取出的安瓿应直接投入 37℃ 温水中，并不时摇动令其尽快融化。

如果安瓿熔封不严，在保存过程中液氮进入安瓿中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，使安瓿变得粉碎，飞溅的玻璃碎片可伤害面部等。

因此，存取安瓿时都要佩戴眼镜和手套，安瓿投入存放温水的器皿中后应立即把盖子扣上，以防发生意外。

（2） 从 37 ℃ 水浴中取出安瓿，用酒精消毒后折断颈部，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加 10 倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，再重复用培养液洗一次。

（3） 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在 37℃ 温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。

细胞复苏时细胞数可以做 10~20 倍稀释，接种密度以 5 x105 /ml 为宜。

（以上节选自《细胞培养》主编 司徒镇强吴军正）

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