细胞冻存后如何有效复苏？

总的来说，应谨记，细胞复苏的原则－快速融化！

具体操作如下：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

37℃水浴溶解，离心去掉冻存液，细胞培养液吹打均匀转移到培养瓶中加够细胞培养液，二氧化碳培养箱培养即可。

1复苏使用前确保细胞保持冷冻

为防止损害细胞活力，切勿将冷冻保存的细胞从液氮转移到实验室。必须始终使用干冰或液氮容器，尤其是要在相当长的距离或时间内运输细胞时。

2快速解冻复苏细胞

从液氮储存器中取出细胞后，应将冷冻管置于37°C水浴中，直到将内容物解冻为止。然后应立即将细胞转移至大量预热培养基中，并滴加更多敏感细胞类型（干细胞，原代细胞）以保持活力。尽管某些细胞可以通过离心沉淀后再用移液管轻轻重悬，然后添加到装有预热生长培养基的细胞培养瓶中，但对于其他类型的细胞，最好（更温和的）将细胞解冻后直接转移到摇瓶中并在第二天进行培养基更换，以去除任何残留的冷冻保护剂。

3确认最近复苏的细胞是健康的

快速的目视检查可以提供细胞健康的早期指示，例如确认粘附的细胞已附着在烧瓶上。初次传代时，任何观察都可以通过可行性检查得到支持。

1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

2. 培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱37°C预热20min，备用。

3. 二甲基亚砜（DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min，备用。

4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400°C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。

6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻 存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

最常用的方法是1.37-42度的热水，快速将冻存细胞溶解 2.将溶解后的1ml细胞加入已经预热到37度的9ml培养基中。3.1000rpm离心10min，弃上清取沉淀。

细胞复苏讲究“快融”，越快融化，细胞所受损伤就越小。细胞复苏的操作不复杂，但每一步都必须稳扎稳打，才能最大限度地提高复苏存活率。

细胞复苏步骤

1：水浴锅预热至37℃备用

2：准备15mL离心管，并向其中加入适量培养基待用 （小贴士：离心管中加入2~9mL的培养基，比较难养的细胞，可适量增加培养基。）

3：将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴锅 （小贴士：如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远（步行超过1min），要把细胞先置于干冰上，再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里，可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。而将细胞冻存管装在PE手套中，是为了预防污染。）

4：用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化 （小贴士：这一步越快融化越好，最好能放计时器在旁边。如果1分钟内没有融化，可能是冻存液量偏多，或者摇晃力度不够。）

5：用纸巾擦拭水渍，转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管 （小贴士：当同时复苏多管细胞时，注意不要弄混。）

6：1200rpm离心3分钟 （小贴士：离心是为了去除DMSO，对于DMSO敏感的细胞，必须离心；若复苏的细胞对DMSO不敏感，步骤6、步骤7可以省略，直接将培养基补足至10mL，接种至培养器皿中，第二天换液。） 步骤7：弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至新的无菌培养器皿中