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总的来说,应谨记,细胞复苏的原则-快速融化!
具体操作如下:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
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37℃水浴溶解,离心去掉冻存液,细胞培养液吹打均匀转移到培养瓶中加够细胞培养液,二氧化碳培养箱培养即可。
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1复苏使用前确保细胞保持冷冻
为防止损害细胞活力,切勿将冷冻保存的细胞从液氮转移到实验室。必须始终使用干冰或液氮容器,尤其是要在相当长的距离或时间内运输细胞时。
2快速解冻复苏细胞
从液氮储存器中取出细胞后,应将冷冻管置于37°C水浴中,直到将内容物解冻为止。然后应立即将细胞转移至大量预热培养基中,并滴加更多敏感细胞类型(干细胞,原代细胞)以保持活力。尽管某些细胞可以通过离心沉淀后再用移液管轻轻重悬,然后添加到装有预热生长培养基的细胞培养瓶中,但对于其他类型的细胞,最好(更温和的)将细胞解冻后直接转移到摇瓶中并在第二天进行培养基更换,以去除任何残留的冷冻保护剂。
3确认最近复苏的细胞是健康的
快速的目视检查可以提供细胞健康的早期指示,例如确认粘附的细胞已附着在烧瓶上。初次传代时,任何观察都可以通过可行性检查得到支持。
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1. 细胞实验室进行常规消毒,紫外照射40min以上。
2. 培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱37°C预热20min,备用。
3. 二甲基亚砜(DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min,备用。
4. 从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入400°C水浴中,快速摇晃,直至冻存液完全融化。
5. 将细胞悬液移入15ml离心管,缓慢加入4ml培养液,离心(1000r/min,5min)。
6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,方培养箱中培养。
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在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏的冻 存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。
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复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化,以避免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。
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最常用的方法是1.37-42度的热水,快速将冻存细胞溶解 2.将溶解后的1ml细胞加入已经预热到37度的9ml培养基中。3.1000rpm离心10min,弃上清取沉淀。
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细胞复苏讲究“快融”,越快融化,细胞所受损伤就越小。细胞复苏的操作不复杂,但每一步都必须稳扎稳打,才能最大限度地提高复苏存活率。
细胞复苏步骤
1:水浴锅预热至37℃备用
2:准备15mL离心管,并向其中加入适量培养基待用 (小贴士:离心管中加入2~9mL的培养基,比较难养的细胞,可适量增加培养基。)
3:将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出,放入PE手套中,迅速投入水浴锅 (小贴士:如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远(步行超过1min),要把细胞先置于干冰上,再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里,可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。而将细胞冻存管装在PE手套中,是为了预防污染。)
4:用力摇晃冻存管,使其在1分钟内融化 (小贴士:这一步越快融化越好,最好能放计时器在旁边。如果1分钟内没有融化,可能是冻存液量偏多,或者摇晃力度不够。)
5:用纸巾擦拭水渍,转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液,缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管 (小贴士:当同时复苏多管细胞时,注意不要弄混。)
6:1200rpm离心3分钟 (小贴士:离心是为了去除DMSO,对于DMSO敏感的细胞,必须离心;若复苏的细胞对DMSO不敏感,步骤6、步骤7可以省略,直接将培养基补足至10mL,接种至培养器皿中,第二天换液。) 步骤7:弃上清,用新鲜培养基重悬细胞,接种至新的无菌培养器皿中