原理
大鼠星形胶质细胞原代培养后，作胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧D-Hanks'液及缺氧培养罐行OGD后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤程度。
材料与仪器
Wistar大鼠乳鼠
FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精
眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱
FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精
眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱
步骤
一、实验步骤
1. 形态学观察：光镜下，传代的星型胶质细胞折光性强，形状不规则，主要为多角形，胞体大而扁平、胞质丰富，细胞核圆形或卵圆形，偏于胞体一侧，内有1-2 个核仁，有多个粗短枝状初级胞突，部分细胞突起变细变长，6-7 天后细胞融合成单层，符合神经胶质细胞生长特性，如下图。
星型胶质细胞单层生长(x100)
1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，经75%酒精消毒，断头处死。
2. 取脑放入冷的D-Hanks'平衡盐溶液，去除脑膜及大血管。
3. 分离两侧大脑皮质并剪成1mm3 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min。
4. 用含10% FBS的DMEM培养基终止消化，离心(1 000 rpm，10 min)，去上清。
5. 用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀，经75μm筛网过滤，收集滤液，再次离心10 min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1.5x106/ml，种植于75 cm2 培养瓶。
6. 经1 小时差速黏附去除成纤维细胞后，将细胞悬液转移到一新的75 cm2 培养瓶继续培养，两天换液一次。
7. 7 天后将培养瓶放入水平摇床(260 rpm，2 h，37℃)，换液弃除小胶质细胞，放入培养箱平衡1 小时，重新置于水平摇床18 h。
8. 换液弃除少突胶质细胞，用新鲜培养基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA 1:1 混合液消化、传代备用。
二、 形态学观察
倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状况。
倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状况。
三、 细胞生长曲线绘制
传代后的细胞以 2x104/ml 的密度种植于24 孔培养板中培养，3 天换液1 次， 每24 小时取3 孔计数，连续7 天，取均值绘制生长曲线。
传代后的细胞以 2x104/ml 的密度种植于24 孔培养板中培养，3 天换液1 次， 每24 小时取3 孔计数，连续7 天，取均值绘制生长曲线。
四、星型胶质细胞的鉴定
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞组织化学鉴定方法。取星型胶质细胞去除培养基，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室温固定1 小时，PBS洗3 次，每次5 分钟，0.3% H2O2 30 分钟以去除内源性过氧化物，PBS洗3 次每次5 分钟，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封闭30 分钟，滴加兔抗GFAP 抗体(1:75)，4℃ 18 小时，PBS洗3 次每次5 分钟，滴加生物素标记羊抗兔IgG，室温20 分钟，PBS洗3 次，每次5 分钟，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温20 分钟，PBS洗3 次，每次5 分钟，DAB显色。
五、结果胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞组织化学鉴定方法。取星型胶质细胞去除培养基，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室温固定1 小时，PBS洗3 次，每次5 分钟，0.3% H2O2 30 分钟以去除内源性过氧化物，PBS洗3 次每次5 分钟，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封闭30 分钟，滴加兔抗GFAP 抗体(1:75)，4℃ 18 小时，PBS洗3 次每次5 分钟，滴加生物素标记羊抗兔IgG，室温20 分钟，PBS洗3 次，每次5 分钟，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温20 分钟，PBS洗3 次，每次5 分钟，DAB显色。
1. 形态学观察：光镜下，传代的星型胶质细胞折光性强，形状不规则，主要为多角形，胞体大而扁平、胞质丰富，细胞核圆形或卵圆形，偏于胞体一侧，内有1-2 个核仁，有多个粗短枝状初级胞突，部分细胞突起变细变长，6-7 天后细胞融合成单层，符合神经胶质细胞生长特性，如下图。
星型胶质细胞单层生长(x100)
图1：星型胶质细胞形成融合状，单层生长(x200)
3. 细胞生长曲线绘制如下：
2. 鉴定：细胞经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均为细胞浆着色，而胞核未见着色，见下图，证明采用上述方法获得的细胞为星型胶质细胞，纯度高， 可用于实验。
图2：免疫组化鉴定，GFAP 染色
3. 细胞生长曲线绘制如下：
图3：细胞生长曲线
来源：丁香实验
