胰蛋白酶消化法（大鼠星型胶质细胞培养实验）

大鼠胚胎
L-15培养基 胶原酶 Dnase D-MEM-BS FCS-DMEM 阿糖胞苷
离心机 水浴锅 培养瓶 培养箱

一、分离大鼠胚胎（16-18周）新皮层，置于L-15（或Hank's平衡盐/DMEM溶液，无Hepes）培养基中，除去脑膜和血管、海马、尾核和其他非皮层组织。

二、 用解剖刀将其切成1 mm³大小的组织块。

三、用1ml枪头转移250 ul 胶原酶储存液（1.33%，溶于L-15中）到1 ml的L-15（或D-MEM）中。每2只鼠脑组织块使用1-1.5 ml稀释胶原酶液。

四、37℃水浴中孵育30 min。

五、1 000 rpm(大约230g)中离心5 min，或3 000 rpm(大约2 000 g)中离心1 min。

六、去上清。

七、在含EDTA-CMF的溶液中重悬细胞，并与胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合。可以根据观察到的细胞消化的情况，适当调整两者的比例。

八、加入胰蛋白酶的抑制剂和DNase溶液，混合5分钟。

九、1 000 rpm(大约230 g)中离心5 min，或3 000 rpm(大约2 000 g)中离心1 min。

十、去上清。加入500 ul D-MEM-BS。

十一、轻轻吹打成单细胞悬液，开始用5 ml枪头吹打10次，在需要时用18-gauge的针头吹打。( 注意：不要产生气泡。）200目/300目尼龙网过滤。

十二、将细胞转移到含10%FCS-DMEM的培养瓶中，培养密度为2X10⁶/25 cm²培养瓶，4～6 X10⁶/75 cm³培养瓶。在37.2℃，37.5%中培养。

十三、第2天换液，以后每隔3天换液。

十四、7-10天，细胞发生融合。

十五、细胞融合后，将瓶盖用封口膜密封好，在轨迹摇床上培养，旋转速度以不产生气泡为宜。37℃振摇过夜。细胞注意避光。

十六、去上清，加入新鲜10%FCS-DMEM。

十七、加入200 ul 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培养基。在37.2℃，37.5%中培养孵育48小时以消除分裂的细胞。

十八、换用新鲜10%FCS-DMEM，孵育恢复24小时。

十九、重复17-18步骤，消除所有的分裂细胞。