材料与仪器
SD大鼠
苯巴比妥 解剖液 胰蛋白酶 Dnase DM培养液
离心管 培养箱 手术器材
苯巴比妥 解剖液 胰蛋白酶 Dnase DM培养液
离心管 培养箱 手术器材
步骤
一、 取14.5d SD大鼠一只。
二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手术台上，酒精棉球消毒皮肤，开腹取出子宫（约12-14个），放入解剖液中，剖开子宫，取出胚胎，放入解剖液中，在耳眼之间离断，取头侧部组织，去除脑膜组织，取原始中脑区组织，放入离心管装的解剖液中，待全部取出后，1500转2分钟。
三、 用吸管吸出上清液，在组织细胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室温30分钟，1500转，离心5分钟（离心前可加入解剖液以终止胰酶作用）。
四、吸去上清，在组织细胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial），37℃反应10分钟，1500转，离心5分钟，吸去上清，在组织细胞沉淀中加入2 ml DM培养液吹打，计数（计数公式为（N1+N2+N3+N4）/4x104），以3x105个/瓶在培养瓶中培养，做好标记（时间、原代还是第几代传代，姓名，细胞名称等），放入培养箱中培养。
二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手术台上，酒精棉球消毒皮肤，开腹取出子宫（约12-14个），放入解剖液中，剖开子宫，取出胚胎，放入解剖液中，在耳眼之间离断，取头侧部组织，去除脑膜组织，取原始中脑区组织，放入离心管装的解剖液中，待全部取出后，1500转2分钟。
三、 用吸管吸出上清液，在组织细胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室温30分钟，1500转，离心5分钟（离心前可加入解剖液以终止胰酶作用）。
四、吸去上清，在组织细胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial），37℃反应10分钟，1500转，离心5分钟，吸去上清，在组织细胞沉淀中加入2 ml DM培养液吹打，计数（计数公式为（N1+N2+N3+N4）/4x104），以3x105个/瓶在培养瓶中培养，做好标记（时间、原代还是第几代传代，姓名，细胞名称等），放入培养箱中培养。
注意事项
1. 麻醉药剂量应梢大于普通用量。
2. 一定要仔细剔除干净脑膜组织，否则会极大地影响培养细胞的纯度。
3. 细胞培养技术不同于分子生物学，由于离心速度较慢，离心组织和细胞贴壁不如核酸紧密，取出离心后的上清液时一定要用吸管吸取，禁止用倾倒的方法。
4. 为保护胚胎，胚胎操作应在放置冰块的托盘中进行，保持低温。
5. 取中脑组织时应先用两把镊子夹住所取区域，然后用刀片切开。
6. 胰酶在细胞离心时会对细胞产生毒性，所以胰酶离心前可加入一定的解剖液稀释。
7. 细胞离心时最好在冰冻离心机内进行，以保持细胞活力。
8. 吹打细胞前用火烧吸管头，发红时逐渐后退，使吸管尖变钝，减少吹打过程中对细胞的损害，实验中也发现吹打时有一定的阻力。
9. 鼠胚胎较多时可分批消化，否则体外时间较长，细胞存活率低。
10. 用Neurobasal medium + B27。
11. 胰酶消化时加入EDTA可增强消化效果。
12. 关键在于取材的准确和原代细胞的状态。
2. 一定要仔细剔除干净脑膜组织，否则会极大地影响培养细胞的纯度。
3. 细胞培养技术不同于分子生物学，由于离心速度较慢，离心组织和细胞贴壁不如核酸紧密，取出离心后的上清液时一定要用吸管吸取，禁止用倾倒的方法。
4. 为保护胚胎，胚胎操作应在放置冰块的托盘中进行，保持低温。
5. 取中脑组织时应先用两把镊子夹住所取区域，然后用刀片切开。
6. 胰酶在细胞离心时会对细胞产生毒性，所以胰酶离心前可加入一定的解剖液稀释。
7. 细胞离心时最好在冰冻离心机内进行，以保持细胞活力。
8. 吹打细胞前用火烧吸管头，发红时逐渐后退，使吸管尖变钝，减少吹打过程中对细胞的损害，实验中也发现吹打时有一定的阻力。
9. 鼠胚胎较多时可分批消化，否则体外时间较长，细胞存活率低。
10. 用Neurobasal medium + B27。
11. 胰酶消化时加入EDTA可增强消化效果。
12. 关键在于取材的准确和原代细胞的状态。
来源：丁香实验
