蛋白质凝胶电泳凝胶的制备

1.  根据垂直电泳槽说明书安装玻璃板，确定需配制分离胶的浓度和体积，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液”所列成分（见书末附录）配制所需分离胶；

2.     迅速将分离胶注入两玻璃板间隙中，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加1cm，用滴管小心地在分离胶上覆盖一层0.1% SDS（当丙烯酰胺浓度≤8%时）或异丁醇或水（当丙烯酰胺浓度≥10%时），覆盖层可防止氧扩散进入凝胶而抑制聚合反应。将凝胶垂直置于室温下；

3.    分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，尽可能排除凝胶上的液体；

4.    确定需配制浓缩胶的体积，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液”（见书末附录）配制所需浓缩胶，然后直接将浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，然后加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙。待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔；

5.    用去离子水将Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液稀释5倍，倒入电泳槽，将加样孔充满，这时加样孔中的气泡可通过电泳缓冲液排除。

2. 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。

3. 在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶乡合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

4. 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或过低无可影响电泳效果。

5. SDS纯度：在SDS-PAGE中，需高纯度的SDS,市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20g SDS放在圆底烧瓶中，加300ml无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min,用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至-20℃冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量-20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。

6. 用SDS处理蛋白质样品时，每次都会在沸水溶中保温3——5min,以免有亚稳聚合物存在。

7. 标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2——0.8之间均匀分布。值得指出的是，每次测定未知物分子量时，都应同时用标准蛋白制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好，对糖蛋白，胶原蛋白等分子量测定差异较大。

8. 对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10-15μl为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。

9. 由于凝胶中含SDS,直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用25%异丙醇内含7%乙酸浸泡，并经常换液，直到SDS脱尽（约需2-3天），才可制备干板。为方便起见，常采用照像法，保存照片。

（1）浓缩效应：样品在开始电泳时，通过浓缩胶浓缩成高浓度的样品薄层；

（2）电荷效应：在均一电势梯度和PH的分离胶中，由于各蛋白质的等电点不同所带电荷量不同，在电场中所受到的引力不同，经过一段时间的电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带；

（3）有分离胶孔径较小，分子量大小和分子形状不同的蛋白质通过分离胶后，所受的阻滞程度不同，因而迁移率不同而被分离。