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BAC/PAC 文库的构建

BAC (Bacterial Artificial Chromosome，细菌人工染色体)文库可用于：（1）全基因组测序；（2）构建物理图谱、染色体步查；（3）基因筛选；（4）基因图位克隆。

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cDNA 文库构建

cDNA文库构建可以：（1）用于分离全长基因进而开展基因功能研究；（2）筛选目的基因并直接用于表达；（3）提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。

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BAC文库的构建

1.目标区域的大小（1）如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。（2）如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。（3）如果目标区域非常大（大于250kb

操作方法所属实验：BAC/PAC 文库的构建

cDNA 文库的构建

)合成足量双链 cDNA 以构建大的文库时，一般需要 5~10ug poly(A)+RNA(—个 90 mm 大小的方瓶，培养哺乳动物细胞长成致密单层可产生 1~2ug poly(A)+RNA)。如果棋板用量较少，仍可有效地进行合成反应，但方案中毎一阶段 cDNA 的损失将成比例增加。当用有限数量的细胞制备文库时，参见本章末信息栏“从少量细胞构建 cDNA 文库"。在开始构建 cDNA 文库前，应当用下述方法对所用 poly(A)+RNA 的完整性进行检査。（1）琼脂糖凝胶电泳和用对照探针进行

操作方法所属实验：cDNA 文库的构建

土井挞克树

实验问答1 回答463 围观

huarenqiang5

实验问答2 回答841 围观

效应机制siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA,而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA.次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程,进一步放大RNAi作用.这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）.三、RNAi表达载体的构建1. 目的基因的确定（1）、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对

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【求助】构建载体

zhangyuxianggx 各位大侠好！现有pcDNA3-mCherry和pGEM-hgene两个东西在滤纸上，老师就说让构建载体，具体是什么意思啊？我理解的是一个真核表达载体和构建好的pGEM质粒，但是不知下一步该怎么做？恳请各位好心的大侠指点一二。 shylook 直接插入cDNA吧 zhangyuxianggx 那个pGEM就是已经插入了DNA的载体。请问这两个东西溶下来以后

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DNA 文库的构建及其筛选

DNA文库的构建和筛选可以用于：（1）将某生物的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，再与适合的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。（2）采用“化整为零”策略，将庞大的基因分解成一段段，每段包含一个或几个基因。

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质粒构建技术

质粒作为低等生物体内的最小遗传单位，具有分子量小、复制速度快等诸多优点，质粒构建为生物工程提供工具载体。

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构建载体

在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

操作方法所属实验：质粒的制备

构建融合蛋白

YPD 平板第 1 天将菌株 7-3 在 YPD 平板上划单克隆，30°C 下培养两天。第 3 天挑取单克隆，在 5 mlYPD 液体培养基中培养，30°C 过夜。第 4 天使用血球计数板测定细胞密度（附录 G)。将细胞稀释至 5X106 个/ml，按照「技术和方案 1，酵母的高效转化」进行高效转化。两个 DNA 样品将被用作转化。GFP 标记的 PCR 产物：lOOpl，含约 8pgPCR 产物。PCR 反应利用「技术和方案 14,PCR 介导基因破坏法」，使用质粒 PFA6a_GFP

操作方法所属实验：基因置换实验

问FC载体构建

Eason老歌迷

是的，每次做抗原还要进行酶切去除，那也太麻烦了。换成羊驼的FC可以省去酶切这一步试一试，看看效果。

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问RNAi载体构建

Eason老歌迷

RNAi载体设计与构建中设计过程如下：有研究以pCDNA3.1(+)载体为基本骨架,在其转录单元的5’端添加了一个自剪切的HDV核酶用于切掉转录后的5’帽子和其基因编码序列的3’端添加了一个自剪切的烟草环斑病毒发夹状核酶用于将3’polyA切掉,又在发夹状核酶下游添加了一个加尾信号BGHpA(牛生长激素加尾信号)。为了更加保险的防止通读现象的发生在BGHpA加尾信号下游添加了一个自我剪切的烟草环斑病毒核酶和能够延缓RNA聚合酶Ⅱ转录的人β-actin基因(Humanβ-actingene)减速

实验问答1 回答755 围观

【求助】关于质粒构建

shinesnowing 想构建一个能通过接合作用进入野生型弧菌并在其中表达外源基因的质粒，现在找到一个名为pBOR8的质粒，只有质粒简图，没找到全序列，质粒上的元件为ori R6K、mob RP4、Ap、lacIq，如下图: 现有两个问题想请教各位高人（1）该质粒能否直接作为表达载体，将外源基因克隆到该质粒上，如果可以通常外源基因应该克隆到哪个位点？（2）如果不能直接进行外源基因克隆和表达，那么应该

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【求助】请教构建载体

xxzjcg 请教构建载体，插于片段670bp，pcDNA3.1质粒5400bp，如果10ul连接体系，插于片段加多少？pcDNA3.1加多少？ woxingwosu pcDNA3.1：片段约为1：3至1：4，其他的成分按照要求来做。 xxzjcg 可是我做了1：4加的，长出几个菌，但菌落PCR是阴性的，请教可能什么原因 cixinkejian 确认下你的

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siRNA 表达载体的构建

siRNA表达载体构建可应用于：（1）作为后基因组时代基因功能分析的有力工具；（2）基因组学、细胞信号传导通路分析；（3）药物靶点筛选、疾病治疗。

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异核体的构建和分析实验

本实验来源「细胞实验指南」黄培堂等译。

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cDNA文库构建

1. RNA 的提取（例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定）。2. 要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。3. 由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。4. 文库构建要选择合适的载体，常规用的是 λ-噬菌体，这是因为 λ-噬菌体 DNA 两端具有由12个核苷

操作方法所属实验：cDNA 文库构建