percoll提取骨髓中性粒细胞

一是离心力没达到 二是percoll两个浓度人为拉开一些

离心速度加大，然后离心时间延长。

可以按这个步骤试试：

1.处死小鼠，分离其胫股骨，剪掉骨髓两端，暴露骨髓腔，用RPMI(-/-)冲洗,70um尼龙筛网过滤，离心收集细胞，3000rpm，4min。弃上清，用3mlRPMI(-/-)重悬细胞;

2.Percoll梯度准备：3ml78%，3ml65%percoll溶液。100%percoll溶液用percoll原液：1undefinedPBS=9：1配制。

3.小心的将细胞悬液置于percoll梯度上，800g,35min,25℃,无制动离心。注：非常重要！！！这个小心放置是非常小心，我看过国外视频，几乎是一滴一滴加入，并且是倾斜角度，以消除重力影响！！！非常重要，一定要非常慢，非常小心，勿震荡。

4.弃掉65%percoll层以上的溶液，收集65%-78%之间的percoll层。注：比较65%与RPMI之间的细胞层，中性粒细胞层较浑浊松散。

5.加入3ml undefinedPBS混匀后，1000rpm 3min离心。弃上清，3ml undefinedPBS重复洗1次。

6.加入1-2ml RBC lysis buffer，混匀后反应1min，1000rpm 3min离心。弃上清，3ml undefinedPBS重复洗2次。弃上清。

7.适量RPMI(-/-)重悬细胞至一定浓度。

一只小鼠大概可以提取undefined10^6-undefined10^6个中性粒细胞，活细胞率非常高，纯度95%以上。提醒：放置梯度percoll和骨髓细胞悬液时。