求助：小鼠原代肝星状细胞提取！！！

给你分享一下我的提取方法吧，说不定对你有所帮助。先原位灌注:1、1ml5%水合氯醛麻醉大鼠，腹壁酒精消毒，十字切口打开腹腔，用湿棉签将肠管推向左侧，暴露门静脉和下腔静脉。2将充满灌流液的针经小口插入门静脉，止血夹或线结扎，软管部分用纸胶布固定以免滑脱。3、灌注I液灌注在肝脏迅速发白后前断下腔静脉，肝脏在全部灌注完后可见白色纹理。可以注射器灌注，也可以使用专门的大鼠灌注器。先灌注液:5min37度\8ml/min。可稍快。再灌注II液:10min37度\5ml/min。一定要慢，防止门静脉破掉。然后再梯度离心:1、灌流结束后，将取适量(直径不超过5cm)肝脏移至无菌培养皿中(镊子泡过酒精。尽量把血管和胆管、胆囊留下)，移至超净台，加入少量(5ml左右)灌注Ⅱ液，前碎肝组织(2mm，尽可能碎)，剔除其他组织。2将搅碎的肝组织倒入50ml的离心管，加入灌注II液至30ml，加入12mg pronase和0.6mg DNase37度水浴消化12~15min，消化过程中每2~3min拿出来轻轻震荡或摇异。3、加入15ml4°C含10%FBS的DMEM终止消化。4、70um 过滤网过滤:用无菌镊子夹出过滤网，放入 10CM无菌培养皿中，将液体用枪打入，有较多沉淀时用1ml无菌注射器尾部粗糙不平部位去研磨，留下的都是一些血管等白色物质后即可停止。5、将过滤后的液体转移至50ml离心管中，静置10min，肝细胞较重沉淀下来，收集悬浮液转移到新离心管中，400g，7min，使所有细胞都沉下去。6、吸掉悬浮液，加入4~5ml15%optiprep液，重悬后转移至15ml离心管，缓慢倾斜至与水平面夹角30度，缓慢加入5ml11.5%optiprep(枪头竖直指向离心管口附近，使液体缓慢流进去)，同法再加5mlHBSS溶液。加完后慢慢竖直可见三种液体明显分层，记住11.5%optiprep与HBSS溶液的分层处。7、1200G，17min4°C离心，加速度1，减速度0。11.5%optiprep与HBSS溶液的分层处可见浅白色的沉淀。8、轻轻收集这些沉淀，加入新的离心管。9、并加入5ml 左右 HBSS，400G，8min离心并去掉液体，留下细胞沉淀。10、加入37°C含10%FBS的DMEM，重悬，再300G，5min离心，吸掉悬浮液后加入2ml含20%FBS和双抗的DMEM重悬。

是不是老鼠年龄太大了，可以考虑换青壮年鼠