常用原代动物细胞培养——肝星状细胞培养

材料

相差显微镜，荧光显微镜，手术器械，雄性SD大鼠，体重250-450 g，戊巴比妥钠，200目尼龙网，小牛血清（或胎牛血清，则更好），DMEM，胰酶消化液（以HBSS配），Nycodenz（以GBSS配），D-Hanks'（KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红 0.02 g/L），HBSS，台盼兰等。

方法

大鼠腹腔麻醉-->剖腹-->门静脉插管-->D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉-->灌以胰酶消化液-->离体肝脏并剪碎-->继续消化-->以尼龙网过滤-->450 g X 5'（4度，下同）-->ppt以HBSS重悬-->混以Nycodenz液-->转至离心管，并覆以HBSS-->1450 g X 16'-->取界面细胞-->重悬、离心收集细胞-->细胞计数，并判断存活率和产量-->按照常规接种-->次日换液。

传代方法：弃培液-->以D-Hanks'液洗两次-->0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->镜下观察细胞突起回缩（2-5分钟左右）-->以完全培液（DMEM+10% NBS）终止反应（若不用EDTA，可以不需离心）-->吹打，1:2-1:3接种，然后继续培养（5% CO2，37度）。

结果

次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。附上本人发表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片（见插图）。

讨论

进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin和alpha-SMA；后者在细胞激活后才表达。也采用过无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！

参考文献

袁桃霞，张锦生，张月娥，等. 大鼠肝Ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学学报 1996;23(2):90-93.