腺病毒包装流程、注意事项与常见问题

流程：

1. 构建腺病毒载体：将目标基因插入腺病毒载体的适当位点，构建重组腺病毒质粒。

2. 选择包装细胞：常用的包装细胞有293细胞和HEK293细胞，这些细胞具有较高的转染效率和腺病毒包装能力。

3. 转染包装细胞：将重组腺病毒质粒转染至包装细胞中，使目标基因与腺病毒包装相关基因共同表达。

4. 收集包装腺病毒：在转染后的包装细胞培养基中收集包装腺病毒颗粒，通常在48-72小时后进行。

5. 纯化包装腺病毒：使用离心、超滤、密度梯度离心等方法，对收集到的包装腺病毒进行纯化，去除杂质。

6. 确定包装腺病毒滴度：通过滴度测定方法，确定包装腺病毒的滴度，即包装腺病毒颗粒的浓度。

注意事项：

1. 选择合适的腺病毒载体和包装细胞，确保高效的包装效率和产量。

2. 严格控制包装细胞的培养条件，包括培养基的成分

腺病毒包装流程如下图，参考一下:

1）进行腺病毒包装相关实验时，穿好实验服，佩戴护目镜、口罩和手套，皮肤不要裸露在外，务必在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

（2）若操作时生物安全柜内有病毒污染（病毒液体溅出），立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

（3）腺病毒包装相关实验使用过的枪头、细胞培养皿、EP管和废弃物等用消毒剂消毒、灭菌后（84消毒液和高温灭菌），再进行统一处理。

（4）腺病毒包装相关实验完毕后，仔细清洁双手。

腺病毒相关实验请在生物安全柜(BL-2 级别)内操作。 操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。 如需要离心,应使用密封性好的离心管,如有必要请用封口膜封口后离心。 动物注射操作请在生物安全柜内(BL-2 级别)完成。 病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌处理。 实验完毕用洗手液清洗双手。 第一代腺病毒载体:E1/E3 基因缺失的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体; 第二代腺病毒载体:E2A/E4 基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体,产生的免疫原性较低,载体容量和安全性方面均提高,但病毒包装难度和出毒滴度严重下降,应用受限。 第三代腺病毒载体:第三代载体缺失了全部的或大部分腺病毒基因,仅保留了两端 ITR 和包装信号。包装容量高达 35kb,免疫原性极低,载体中引入核基质附着区基因用于外源基因长期表达并增加了载体的稳定性。但第三代载体系统需要腺病毒突变体作为辅助病毒。 目前,第一代腺病毒载体仍是科研和临床应用最为广泛的腺病毒载体,因此更为推荐。 需要根据自己实验室的经验以及需求进行选择。 纯化后的腺病毒可以去除缺损的病毒颗粒、细胞毒素、细胞培养基、以及细胞碎片等杂质。纯化腺病毒免疫原性较低,更适合做动物实验。