植物组织透射电镜制备

制备植物组织的透射电镜样品需要进行以下步骤 :

1.取得植物组织样本。2.修剪和切片。3.固定。4.洗涤。

5.脱水 。6.渗透。7.浸透和嵌入。8.超薄切片。9.样品染色。10.观察和拍摄。

制备植物组织的透射电镜样品需要进行以下步骤：

1. 取得植物组织样本：选择需要研究的植物组织，例如叶片、茎或根。确保样本新鲜并处于适当的生理状态。

2. 修剪和切片：使用锋利的刀片或切片机将植物组织修剪成较小的片段。确保切片时避免气泡和损伤。

3. 固定：将切片的植物组织固定在适当的固定剂中，例如醛缩固定剂（如乌头醛或戊二醛）。遵循适当的固定剂使用浓度和时间。

4. 洗涤：用缓冲液洗涤固定的植物组织，以去除多余的固定剂。重复洗涤步骤可以帮助减少固定剂残留。

5. 脱水：通过一系列浓度递增的乙醇或丙酮溶液，逐渐将植物组织中的水分去除。通常使用30%、50%、70%、90%和100%的溶液。

6. 渗透：将脱水的植物组织置于适当的渗透剂中，例如丙酮/树脂混合物，以便渗透和替换溶剂。这一步通常需要多次更换渗透剂，确保充分渗透。

7. 浸透和嵌入：将渗透的植物组织浸入切片架（如EPON或Spurr树脂）中，随后在适当的温度下进行固化，以形成坚硬的块。

8. 超薄切片：使用超薄切片机或刀片，将块切割成约70-90纳米厚度的薄片。这些薄片将用于透射电镜观察。

9. 样品染色：使用适当的染色剂（如铀酸和铅染剂）对薄片进行染色，以增强电镜图像的对比度。

10. 观察和拍摄：将染色的透射电镜样品放置在透射电镜网格上，然后放入透射电镜中进行观察。使用透射电镜拍摄图像以获得所需的数据。

制备步骤：

1. 生物样品负染：滴在铜网上的样品溶液经1-2%的磷钨酸（PTA，pH6.5-7.0）染色5-10s后干燥，在透射电镜中观察。

2. 生物样品超薄切片制备流程：材料样品的超薄切片制备参见步骤2.4和2.5。

样品取材要求：

（1）新鲜。（材料离体后1-5min内进入固定液，避免细胞自溶和结构变化）

（2）体积小。（厚度< 1mm，长度宽度均< 5mm，固定液渗透能力有限，组织太大会导致无法固定充分）

（3）机械损伤小。（动作轻巧，器械锋利，避免对阻止的挤压和推拉，建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。）

（4）低温操作，器械、容器、固定液均需预冷。（降低酶的活性，减少组织自溶）

（5）取材部位准确，且注意材料的方向性和定位。

2.1取样&固定：

2.1.1取样及戊二醛固定

戊二醛（多为2.5%），超纯水配成6-10%的水溶液，使用前加0.2M磷酸钠缓冲液稀释至所需浓度（有细胞壁的样品5%，无细胞壁样品3%，磷酸缓冲液终浓度0.1M，PH7.2），现配现用。可根据样品选择其他缓冲体系。

切取一小块组织，置入预冷的戊二醛固定液（3-5%）中，4℃预固定20分钟后，捞出置于洁净的保鲜膜或培养皿上（已滴有预冷的固定液），在固定液中用将组织切成2-5mm长， 2-3mm宽， 1mm厚的细条，移入盛有预冷的戊二醛固定液的2ml离心管中，4℃固定过夜。

（1）植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后，可用真空泵抽出组织内部的气体，使材料沉入固定液中。