透射电镜的基本结构和原理

电子显微镜(electron microscopy，EM) 简称电镜，经过五十多年的发展已成为生物学、医学、化学、农林和材料科学等领域进行科学研究的重要工具，是人类认识自然，特别是研究机体微细结构的重要手段，电镜技术已成为上述各领域研究工作者应掌握的一项基本技能。电镜的创制者鲁斯卡(E.Ruska)教授因而获得了1986年诺贝尔奖的物理奖。

与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。电子与物质相互作用会产生透射电子、弹性散射电子、能量损失电子、二次电子、背反射电子、吸收电子、X射线、俄歇电子、阴极发光和电动力等等。

电镜就是利用这些信息来对试样进行形貌观察、成分分析和结构测定的。电镜有很多类型，主要有透射电镜 (transmission electron microscope，TEM) (简称透射电镜)和扫描电镜 (scanning electron microscope，SEM) (简称扫描电镜)两大类。本文仅讨论在生物医学领域使用广泛的透射电镜和扫描电镜。

透射电镜和光学显微镜最基本的原理是相同的，显微放大过程基本相似，电镜的光路和部件术语基本一样。不同的是，电镜的照明源不是可见光而是电子束；透镜也不是玻璃而是轴对称的电场或磁场，电镜的总体结构、成像原理、操作方式等与光学显微镜有着本质上的区别。

　　一、基本结构

透射电镜由电子光学系统、真空系统和电子学系统三大部分组成。

(一)电子光学系统

电子光学系统即电镜的镜体，基本上是一个电子透镜系统，一端是电子源，另一端是观察和记录系统，中间是安装样品的装置(图19-1)。

1． 照明系统　由电子枪和聚光镜组成。其作用是为成像系统提供一个亮度高、尺寸小、高稳定的照明电子束。

电子枪是电镜的照明源，由灯丝阴极、栅极 (或称韦氏圆筒)和加速阳极组成(图19-2)。

聚光镜的作用是将来自电子枪的电子会聚到样品上，通过它来控制照明电子束斑大小，电流密度和孔径角。

2．成像系统　包括样品室、物镜、中间镜和投射镜（或两个中间镜或两个投射镜构成4～5个透镜系统）。

（1）样品室：室内有样品台，电镜的样品载于载网上，载网放在样品架(或称样品筒)上。

（2）物镜：其作用是形成样品的第一级放大像和通过调节物镜线圈的激励电流，相应地改变物镜的焦距从而对像进行聚焦。物镜是电镜的最关键部分，由它获得第一幅具有一定分辨本领的电子放大像。物镜中任何缺陷都将被成像系统其他透镜进一步放大。因此，电镜的分辨本领主要取决于物镜的分辨本领。

（3）中间镜和投射镜：中间镜的作用是把物镜形成的一次放大像或衍射花样投射到投射镜的物平面上，再由投射镜放大投射到荧光屏上而获得终像。

投射镜的作用是把中间镜形成的二级放大像再放大投射到荧光屏上，从而形成终像。

3．像的观察和记录系统　在投射镜下面是像的观察和记录系统。

在荧光下面是照相暗盒，它和电磁快门、曝光表组成像的记录系统，用于把终像拍摄记录下来。现代透射电镜一般还配备有CCD相机，实现数字化成像，结合相关的软件还可以进行图像的分析处理。

　　二、基本原理

(一) 分辨本领与放大倍数

分辨本领是指能够分辨物体上两点之间的最小距离。光学显微镜与电镜的分辨率相差达1000倍，因为光镜的分辨本领受到衍射效应的限制。当光线从一点出发透过显微镜时，所成的像不再是一点而是一个周围带有阴影的光斑。如果物体上两个质点靠得很近，所成的像就可能分辨不清。也就是说，光的波动性给光学显微镜规定了一个分辨本领的限制。光镜的分辨本领最终只能达到约为照明波长的0.4倍。

放大倍数是指物体经过仪器放大后的像与物的大小之比。放大了的像还可多次放大，但到一定限度后继续放大时便不能增加细节，这是分辨本领的限制所致。不能增加图像细节的放大倍数称为空放大，而与分辨本领相应的最高放大倍数称为有效放大倍数，为眼的分辨本领与仪器的分辨本领之比。

(二)电子波（束）特性

为了提高显微镜的分辨本领，就需要寻找波长更短的光波作照明。1924年法国学者德.布罗依(De.Broglie)等人创立了波动力学，提出了物质波的概念，指出高速运动的粒子不仅具有粒子性，而且具有波动性。这个假设不久就为电子衍射实验所证实。衍射是波动的特性，高速运动的电子能发生衍射，证明它是一种波。它具有波动所具有的共同特征量——波长、频率、振幅、相位等，并且服从于波动的规律。

(三)磁透镜的光学性质和聚焦原理

电镜实质上是电子透镜的组合。电子透镜有静电透镜和磁透镜二种。

磁透镜的聚焦原理：电子在进入磁场后受到磁场(洛伦兹力)作用，使电子束产生两种运动——旋转和折射，而电子在磁场中的旋转与折射是各自进行的。因此，在讨论磁透镜的聚焦作用时就可以暂不考虑电子的旋转，这样，电子在磁透镜的折射与光通过玻璃凸透镜的聚焦作用相似了。正如玻璃凸透镜可用于放大成像一样。磁透镜也能用于放大成像，而且还可以借用几何光学中的光线作图法与术语，如用焦点、焦距、物距、像距等概念来描述电子在磁透镜的运动轨迹。

　　三、超薄切片技术

透射电镜的成像是由一定强度的电子束透过标本而成像。由于电子射线的穿透能力比较低，电镜又具有很高的分辨率和放大率，因此, 电镜标本需要厚度在0.03～0.05μm的超薄切片，以获得高分辨的超微结构图像。

超薄切片制作过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节。

（一）取材

取材是超薄切片技术的关键环节。由于生物组织离体后，细胞将会立即释放出各种水解酶引起细胞自溶，使细饱内部微细结构发生变化。因此，为尽可能避免产生人工假像，取材时有以下要求：

1． 取材要快，一般要求在1min内把组织块浸入固定液。

2． 组织块要小，一般切成0.5～1.0mm。

3． 所用固定液及容器须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶。

4． 由于电镜观察视野小，具有很大的局限性，所以，选择部位要准确可靠。

5． 切割组织的刀、剪必须锋利干净，避免拉、锯、压等动作造成细胞损伤。

（二）固定

1. 固定的作用 标本固定在于：

①破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；

②稳定细胞物质成分，如核酸、核蛋白，糖类和脂类，使之发生交联，减少或避免抽提作用，以保存组织成分；

③在一些细胞组分之间以化学反应和物理反应建立交联，以提供一个骨架来稳定各种细胞器的空间构型；

④能提供一定的电子反差。

2. 常用的固定剂　理想的固定剂须具备的条件有：

①能迅速渗入组织细胞内，尽快固定细胞以减少组织自溶；

②能稳定细胞各种结构成分，使其在脱水、渗透及包埋等过程中不溶解和丢失；

③避免细胞结构膨胀或收缩，以保证获得真实结构的电镜图像；

④能保存酶的活性以供电镜细胞化学研究。目前尚未找到一种能满足上述全部功能的理想固定剂，较理想和常用的固定剂有四氧化锇、醛类、高锰酸钾等。

（1）四氧化锇 (Osmium tetroxide)俗称锇酸，为一种强的氧化剂，呈浅黄色结晶，其分子式OSO4，熔点41℃，沸点131℃，在水中的溶解度为7.24%(25℃) 。其水溶液为中性，有极大的毒性。

（2）戊二醛(glutaraldehyde)分子式为C5H8O2。市售的戊二醛通常是25%或50％的水溶液，其pH为4.0~5.0, 并保存在低温处, 且不宜存放时间过长。

（3）高锰酸钾是一种强的氧化剂，对磷脂蛋白类有特别良好的固定作用。可用于保护细胞的膜相结构，如细胞膜、内质网等。尤其是对神经髓质效果更为显著，但对于胞内的颗粒性或纤维状结构几乎不能固定。常用于植物叶绿体结构及神经纤维结构的研究。

3. 固定方法　目前，用于生物样品超薄切片技术的主要固定方法是化学固定法。采用戊二醛 (或戊二醛+多聚甲醛)固定l～3h后，经相应的缓冲液冲洗，再用1%锇酸后固定1～2h。

生物样品有多种多样，对于不同的材料和组织部位，其固定方式是不同的。

（1）浸泡固定：适用于一些能允许在短时间内停止供血而仍保持其功能和结构的器官或组织，以及一些病理检查的样品。其方法是经解剖 (或手术)尽快从机体中取出所需组织，并按取材要求，把组织切成小块，放入小瓶子内作常规双重固定。

（2）血管灌注固定：适用于取材较复杂或对缺氧较敏感的器官或组织，须采用血管灌注固定。可根据动物的大小选用全身灌注或局部灌注的方式。

（3）培养细胞的固定：如所固定材料为微生物、单细胞原生动物、细胞提取物或组织培养的细胞，则应先离心倒去上面的培养液 (或上清液)，然后才按常规方法进行双重固定。戊二醛固定时间为15～30min，锇酸固定时间为15～40min。

对于试管或培养瓶培养的单层细胞，在倾去培养液后，即加入前固定液，并轻刮下细胞，用2000r/min离心15～20min，使细胞成团。然后倾去上清液，再缓慢加入新鲜的前固定液，以免将细胞团冲散，并继续进行双重固定。

4. 固定时注意事项

（1）固定液的浓度：固定液浓度要适宜。一般戊二醛常用浓度为1％～4％,锇酸为1％～2％。

（2）固定液的渗透压：固定液的渗透压须调节到接近组织、细胞的生理值。固定液的渗透压是通过改变缓冲液的浓度或者通过增加钠、钙和镁等电解质或葡萄糖和蔗糖等非电解质来调节的。

（3）固定液的pH值：固定液pH值须接近所要固定组织的pH值。由于大部分动物组织的平均pH值约7.4, 因此，电镜固定液的pH值都选用中性 (7.2～7.4)。

（4）固定时的温度 理论上，低温能降低酶的活性，减少细胞自溶和胞内物质的抽提，因此，大部分样品宜在0℃～4℃下固定。

（三）脱水

脱水是指用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水，因水分的存在会使组织结构在电镜高真空状态下急剧收缩而遭破坏，另外包埋剂是非水溶性的，细胞中的游离水会影响包埋剂的浸透，因此，脱水是一个很重要的步骤。

1. 常用脱水剂 常用脱水剂有乙醇、丙酮和过渡液环氧丙烷等。其中，因乙醇引起细胞中脂类物质的抽提较丙酮少，且不使组织材料变硬、变脆，为最常用脱水剂。但乙醇不易和用于包埋的环氧树脂相混溶，为此在转入包埋剂前，要用“中间脱水剂”——环氧丙烷过渡，它比乙醇和丙酮易与环氧树脂混溶，且挥发快，利于浸透和包埋。

2. 脱水的原则和方法　生物样品中的水分占据着一定空间，急剧脱水会引起细胞收缩，必须采用“等级系列脱水法”，即用逐级加大脱水剂的浓度逐步把水分置换出来。一般标本在30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇或丙酮停留5～10min，100％乙醇或丙酮3次，每次10～15min。

室内相对湿度要在50%以下。根据标本本身结构致密程度或特殊需要，可适当延长或缩短脱水时间，选择合适的起始浓度或增加脱水系列的等级。

用100%乙醇或丙酮脱水时，必须先用无水硫酸铜或用无水氧化钙吸收脱水剂中的水分，以保证组织细胞充分彻底脱水。另外脱水时间不可过长，以尽量减少细胞成分的抽提和丢失。

（四）渗透与包埋

渗透和包埋的目的是取代活组织中的水分以及支持整个结构，以便标本有特定的机械性利于切片。

1. 常用包埋剂及配方　包埋剂种类颇多，目前普遍使用的是环氧树脂。为改善包埋块的切割性能，有时在环氧树脂包埋剂配方中再加一些增塑剂，以调节包埋块的韧性。

环氧树脂包埋剂对细胞微细结构有较好的保存性能，聚合后体积收缩率较小，为2％～5％，而且在真空中能经受较长时间的轰击。但它操作不大方便，反差较弱。

环氧树脂的型号较多，常用Epon812、Spur树脂(ERL-4206) 、TAAB812，还有国产的环氧树脂618和600等。

2. 渗透与包埋步骤　样品在完全脱水后，即可进入渗透。第一步是将样品置于100％脱水剂及等量包埋剂的混合液中(室温下30min或数h)；第二步是将样品置于纯包埋剂中(室温6h或过夜),然后可行包埋: 将渗透后的样品挑入已装有包埋剂的多孔橡胶模板中，将包埋剂灌满，放入标签，然后根据包埋剂聚合时所需的温度及时间聚合，制成包埋块。

（五）超薄切片

超薄切片的最大面积为0.5mm×0.5mm左右，要切出较理想的超薄切片，不仅超薄切片机质量好，还要有渗透、包埋好的包埋块，以及要有好的切片刀和操作者技术熟练等。其步骤是：

1. 定位、修块　定位、修块是指保留要进行电镜观察部分，把其余部分削去，以利进行超薄切片。

2. 制刀　用于超薄切片有钻石刀和玻璃刀。玻璃刀因价格低廉而被常用。

玻璃刀经检查后的刀还须在刀上作一小水槽，以便在切片时让切下来的超薄切片漂浮在液面上。为防止漏水，边沿须用石蜡或指甲油焊封。在焊接时，应注意刀刃不要粘上石蜡或其他的焊封剂，以免损伤刀刃。

3. 载网和支持膜制备　超薄切片须置于一种载网上才能进行观察。载网一般采用很薄的铜片，此外，还有镍网、银、钼、不锈钢、尼龙等材料制成的载网。

（六）超薄切片机

超薄切片机有热膨胀式和机械进刀式两类，后者较常用，它是以微动螺旋和微动杠杆来提供微小进刀而切出切片，如Leica超薄切片机。

（七）切片染色

（1）染色的作用：所谓电子染色是利用某些金属盐(如铅、铀、锇等)能与细胞的某些结构和成分结合，以增加其电子散射能力，进而达到提高反差的一种方法，不同结构成分上吸附有不同数量重金属原子，结合重金属原子较多的区域(即结构致密、原子序数高的部分)具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现为电子致密的黑色；结合重金属原子较少的区域则为浅黑色，灰黑色，没有结合重金属的区域是电子透明的区域，因此，经过电子染色处理可提高样品反差，增加图像清晰度。

（2）电子染色剂：

1）醋酸铀：也称醋酸双氧铀，是广泛使用的染色剂，它以提高核酸、蛋白质和结缔组织纤维的反差为主，对膜染色效果较差。

2）柠檬酸铅：目前使用最广泛的电镜染色剂，密度大，对各种组织结构都有广泛的亲和作用，尤以提高细胞膜系统及脂类物质的反差为好，对不能被锇酸染色的糖原更具有染色作用。

（3）染色的方式：由于铀和铅具有不同的染色特征，所以目前切片普遍都采用双重染色。即先用醋酸铀染色后，再用柠檬酸铅染色，相互补充，从而获得较佳的染色效果。

　　四、免疫电镜技术

免疫电镜技术是把免疫化学技术与电镜技术有机的结合，用高电子密度的标记物(如铁蛋白、金等)或用经细胞化学方法处理后达到电子密度升高的标记物 (常用辣根过氧化物酶或酸性磷酸酶等)标记抗体、与组织中的相应抗原结合, 并用电镜观察的一种技术。现在，免疫电镜技术已广泛地应用于生物、医学各个研究领域，使结构与功能研究融为一体。

（一）铁蛋白标记技术

铁蛋白标记是一种最基本的免疫电镜技术,曾广泛用于检测病毒和细胞膜表面的抗原，具有抗原抗体反应性好，能较正确地观察抗原分布等优点。

（二）免疫酶技术

将酶和抗体结合，但这种酶-抗体结合物仍然保持该抗体和酶的活性，结合物中的抗体与相应组织或细胞内的抗原特异性结合，形成不溶性复合物，然后通过相应的组织化学方法将酶显示出来, 称免疫酶技术。

用于标记抗体的酶有辣根过氧化物酶 (HRP)、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、细胞色素C、微过氧化物酶 (microperoxidase)等，最常用的是HRP。

1. 酶标记抗体法

（1）直接法：用酶标识的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，再进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。该法的优点是简便、快速、特异性强。缺点是对于所显示的抗原，必须将其相应的特异抗体分别进行标记，在很大程度上限制了本法的应用。

（2）间接法：依次先后使用两种不同的抗体，先使用未经标记的特异性抗体即第1抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过氧化物酶标记的第2抗体，最后酶与底物反应，生成沉淀。第2抗体是抗第1抗体的抗体。间接法的优点在于：即同一种酶标记抗体，可与多种1抗配合，检测多种抗原。

2. 非标记抗体酶法（PAP法） 具有特异性强、敏感度高等优点。

该法首先用HRP免疫动物制备高效价的抗酶抗体，HRP通过免疫反应形成免疫复合物(PAP复合物)，因此，它不仅保留了酶的活性而且也保存了抗体的活性，PAP复合物是通过两级抗体与组织细胞内抗原结合的，第一级抗体为特异性抗体，能与组织中某种抗原特异性结合；第二级抗体是联系抗体，它的两个Fab段能分别与特异性抗体(一抗)和PAP复合物的Fc段相结合，所以，要求特异性抗体和PAP复合物抗血清必须来源于同一种动物。

PAP复合物与抗原结合后还要进行呈色反应和锇化，生成电子密度较高的锇黑，以利电镜观察。PAP法有包埋前染色和包埋后染色。

（三）免疫金探针技术

胶体金是指1～150nm金微粒分散在水溶液中组成的金溶胶，它是一种疏水的胶体，带负电荷。用于免疫细胞化学的胶体金微粒直径一般为5～60nm，均呈红色，直径超过100nm或稳定性受到破坏形成凝集物皆呈蓝色。免疫金探针技术包括“包埋前”染色法和“包埋后”染色法。　

1. 实验一 蛋白标记抗体的应用　用于细胞表面和细胞内部相应抗原的定位和定性。

细胞内抗原观察的方法如下：

①将待检组织切成3～5mm的小块，浸入5%福尔马林，4℃条件下固定30～60min;

②冷PBS充分洗涤 (10min以上);

③将组织块在干冰丙酮或液氮中速冻，室温中融化，重复3次;

④用振动切片机将组织块切成50μm的厚片;

⑤将厚片浸在兔抗人球蛋白抗体溶液中;

⑥大量冷PBS在4℃下充分洗涤，至少30min，中间换洗涤液3次,边搅拌边洗涤;

⑦组织浸入铁蛋白标记抗体溶液中，置室温30～60min;

⑧重复⑥；

⑨切片用1%四氧化锇固定30min;

⑩梯度丙酮或酒精脱水;{11}常规包埋，超薄切片，2%双重染色，电镜观察。

为了确定方法的特异性，必须做对照实验,较常用的是将标本用未标记的抗体处理，30min后洗涤，再用该抗体的铁蛋白标记物孵育，使标本在电镜下呈阴性结果。

2. 实验二 包埋后染色PAP法　

①新鲜组织经固定后 (勿用OsO4后固定)，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，超薄切片。

②用镊网捞片置于5% H2O2溶液中刻蚀3min后用生理盐水洗。

③正常羊血清1:30(用0.1MPBS稀释pH7.4)室温5min。

④兔抗血清(用0.1MPBS,pH7.4)内含l%正常羊血清，4℃冰箱内处理48h，然后用TBS漂洗。

⑤正常血清1:30室温5min。

⑥羊抗兔IgG l:10 (用0.1MPBS稀释)室温30min后用TBS洗涤。

⑦正常羊血清 (1:30)室温5min。

⑧兔PAP复合物 (内含l%正常羊血清)，室温5min后用TBS洗涤。

⑨DAB·4HCl/H2O2 (0.0125%/0.0025%))室温15min后用0.1MPBS洗。

⑩1% OsO4后固定10～15min。水洗后用醋酸铀单染或不染。电镜观察。

对照实验：吸收实验是将足量的抗原如P物质加入抗P物质的血清内，离心取其上清液，用这样的血清代替一抗，结果应为阴性;替换试验是用正常血清为第一抗体，结果为阴性。

3. 实验三 组织免疫金“包埋后”染色　

①取适当固定（按免疫固定方法固定）的新鲜组织，经常规脱水、浸透、包埋（Epon812或低温包埋剂），制成电镜样品块；

②将60～80nm的超薄切片收集在镍网上，空气干燥；

③将干燥后切片置于1%～10% H2O2中处理1～10min(根据环氧树脂硬度调H2O2浓度）；

④双蒸水洗3次，每次5min；

⑤0.1M PBS （pH7.4）（内含0.5% Tritonx-100）洗3次，每次5min；

⑥置1%EA（PAG）或1∶5的正常羊血清（SARG）处理20min；⑦加适当稀释一抗，4℃20h，室温2h；

⑧用0.1M PBS （pH7.4），洗3次。每次10min；

⑨加入1% EA（PAG）或1∶5正常羊血清（SARG），10min；

⑩适当稀释的PAG，室温2h；{11}0.1M PBS （pH7.4），浸洗3次。每次10min；{12}双蒸水洗3次，每次5min；{13}常规铀、铅染色，电镜观察。

　　五、负染色技术

负染色又称阴染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。所谓负染，是指通过重金属盐加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。

在超薄切片的染色中，染色后的样品结构的电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮。这种染色称为正染色。而在负染色中则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)“包埋”低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明”的光亮。两着之间的反差正好相反，故称为负染色。

对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术较之超薄切片方法具有分辨率高(可达15?魡) 、简单快速等优点。因此在生物学研究中得到越来越广泛的应用,可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征,尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。

（一）负染色液的制备

用作负染色的物质应具有：

①较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；

②熔点高，在电子束的轰击下不会升华；

③溶解度大，不易析出沉淀；

④在电镜下不呈现出可观察到的结构；

⑤分子小，易渗入不规则表面的凹陷处；

⑥与样品不起化学反应等。目前最常用的负染液是磷钨酸(PTA)、磷钨酸钾(KPT)和磷钨酸钠(NaPT)。此外，醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。

（二）染色方法

1. 悬滴法　用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。滴液后静置数分钟。然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。

2. 喷雾法　将染色液和悬液样品等量混合，带特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干可用于电镜观察。

3. 漂浮法　先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的液滴上漂浮。

（三）操作的注意事项

1. 悬液样品的纯度　待染色的悬液样品如果杂质太多将会干扰染色反应和电镜的观察，因此样品必须进行适当的提纯。

2. 悬液样品的浓度 第一次制样时，同时几种浓度样品进行滴样，从而选取浓度适中者进行观察。浓度太低时电镜下寻找样品很困难; 浓度过高，可因样品的堆集而影响观察。

3. 样品和染色液的均匀分布问题 生物大分子样品或病毒样品最好使用碳膜作支持膜，使用其他支持膜，在电镜观察时往往会发生样品漂移，而不能拍摄。但是由于碳膜的疏水性会使样品及染色液凝集。在电镜观察时往往由于样品和染色剂浓密的堆集而无法看清样品的结构细节。为提高染色效果，需要设法使样品和染液均匀分散，可采用以下方法。

（1）使用分散剂:常用分散剂有牛血清蛋白(BSA)，适用于高度纯化的颗粒性悬液；也可以用杆菌肽，用作沉淀物的稀释液；或将样品悬液、PTA和杆菌肽溶液三者等量混合后滴样。

（2）对碳膜进行亲水性处理:把覆盖在铜网上的碳膜放在离子溅射仪中，在10Pa～1Pa的真空中用离子轰击(蚀刻)几秒钟，碳膜即由疏水性变为亲水性，为防止其重新变回疏水性，最好于亲水性处理后即行使用。

（3）样品悬液和染色液的酸碱度问题:样品悬液和染色液的酸碱度会对负染色的结果产生较大的影响。为了确保生物样品有足够的缓冲条件，一般用2%醋酸氨或硫酸氨作缓冲液效果较好，并且使悬液的酸碱度呈中性或稍偏酸为宜。

（4）负染色的时机:染色时机十分重要。滴染色液一般既不要在生物样品完全干了之后,更不要在载网上尚有肉眼可见的水珠时就着手染色。恰当的时机应是用滤纸吸去悬液之后稍待片刻，当肉眼看不出残留的液体时滴加染色液。如果载网上尚有悬液残存时就进行染色，或者完全干后再染色效果都不佳