透射电镜观察法检测巨自噬

在超薄切片上能够清晰地观察到自噬结构的形态和构造，故透射电镜观察法检测巨自噬是细胞自噬研究的常用技术。

在超薄切片上能够通过透射电镜清晰地观察到自噬结构的形态和构造。

器材：离心机、烘箱、切片机、透射电镜、细胞或组织。

试剂：PBS; 消化液（0.125％ 胰蛋白酶；标本处理试剂（2.5％ 戊二醛、1％ 锇酸、0.1 mol/L 磷酸漂洗液等）；乙醇；丙酮，树脂，醋酸双氧铀，枸橼酸铅。

1、用 PBS 浸洗细胞 2 次，然后经 0.125％ 胰蛋白酶消化收集细胞，离心（1 000 r/min，5 min)。

2、吸去上清液，加入 2.5％ 戊二醛，在 4 ℃ 条件下预固定细胞 2 h。如为组织样本，将组织切成 1 mm 3 小块，用同样方法预固定。

3、用 0.1 mol/L 磷酸漂洗液浸洗细胞团或组织块 3 次，每次 15 min。然后，在 50％、70％、90％ 乙醇中逐级脱水，各 15 min。

4、在 4 ℃ 条件下用 90％ 乙醇和 90％ 丙酮混合液（1:1）置换乙醇，再用 90％ 丙酮置换，各 15 min。

5、在室温下用纯丙酮置换 3 次，每次 20 min。

6、用 0.1 mol/L 磷酸漂洗液浸洗 3 次，每次 15 min。

7、用 1％ 锇酸固定 2~3 h。

8、用 0.1 mol/L 磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次 15 min。

9、将标本放入纯丙酮和 Jpurr 树脂（2:1）混合液中浸透，室温条件下放置 3 h。然后，在纯丙酮和 Jpurr 树脂（1:2）混合液中过夜。

10、在 37 ℃ 条件下，Jpurr 树脂中放置 2 h。

11、37 ℃ 烘箱中过夜，45 ℃ 烘箱中放置 12 h，最后在 60 ℃ 烘箱中放置 24 h。

12、用超薄切片机作超薄切片，然后用 3％ 醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色。

13、在透射电镜下观察细胞内的自噬结构。