LC3免疫染色法检测巨自噬

LC3 免疫染色法检测巨自噬是自噬体标记的常用方法。

LC3 免疫染色法检测巨自噬的基本原理是巨自噬多由较大的物体如变性线粒体诱导发生，自噬结构体积较大，在透射电镜和共聚焦激光扫描显微镜下都可观察到。

器材：

① 盖玻片

② 恒温培养箱

③ 共聚焦激光扫描显微镜

④ 细胞

试剂：

① 清洗液 PBS

② 固定液 4％ 多聚甲醛

③ LC3 抗体

LC3 免疫染色法检测巨自噬的基本过程可分为如下几步：

1）将细胞接种在盖玻片上，培养 2~4 h；

2）用 PBS 浸洗，然后用 4％ 多聚甲醛固定 20 min；

3）用 PBS 浸洗两次，再用 0.5％ Triton X-100 处理细胞 5 min；

4）PBS 浸洗后用 3％ BSA 孵育 30 min；

5）加入 LC3 抗体（1:100），在 4 ℃ 条件下过夜；

6）用 PBS 清洗 3 次，然后加入 FITC 标记的 IgG（1:100），在 37 ℃ 条件下孵育 30 min；

7）PBS 清洗后，用 DAPI 或 PI（1:1000）染细胞核；

8）磷酸缓冲甘油封片，在共聚焦激光扫描显微镜下观察 LC3 阳性结构。

在细胞铺展充分时染色，可降低 LC3 阳性结构重叠。