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巨自噬检测实验

实验分类:

细胞实验

别名:

macroautophagy

最新修订时间:

简介

Ashford 和 Proter(1962 年)最早发现,在肝灌流液中加入高血糖素后,肝细胞的溶酶体增多并发生自食(self-eating)现象。后来人们将该现象命名为自噬(autophagy)。随着技术方法的发明和改进,近年来哺乳类动物细胞自噬机制及其与疾病发生关系的研究进展非常迅速。自噬是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器,最终将吞噬物在溶酶体内降解的过程。按吞噬物进入溶酶体的途径,自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬 3 类。巨自噬(macroautophagy),细胞通过自噬基因调控组装呈双层膜的自噬前体。自噬前体包裹细胞质、细胞器或细菌等形成自噬体。目前,用于检测巨自噬的方法主要有 2 种:透射电镜观察法和 LC3 免疫染色法。

原理

巨自噬检测实验的基本原理是巨自噬(macroautophagy)是细胞通过自噬基因调控组装呈双层膜的自噬前体。自噬前体包裹细胞质、细胞器或细菌等形成自噬体。在微管的运输作用下,自噬体与溶酶体靠近,自噬体外层膜与溶酶体膜融合,包有内层膜的自噬体进入溶酶体,形成自噬溶酶体。在晚期自噬溶酶体,自噬体内层膜被溶酶体酶降解,继而内容物被降解,可溶性小分子物质经自噬溶酶体膜渗透入细胞质,被细胞重新利用。巨自噬多由较大的物体如变性线粒体诱导发生,自噬结构体积较大,在透射电镜和共聚焦激光扫描显微镜下都可观察到。

来源:丁香实验团队

操作方法

透射电镜观察法检测巨自噬

在超薄切片上能够清晰地观察到自噬结构的形态和构造,故透射电镜观察法检测巨自噬是细胞自噬研究的常用技术。

LC3免疫染色法检测巨自噬

LC3 免疫染色法检测巨自噬是自噬体标记的常用方法。

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