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脾脏原代培养细胞中提取RNA

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科研小废物一枚

取小鼠脾脏细胞(混悬液)铺六孔板培养72小时后,从贴壁细胞中提取RNA。(有加1×红细胞裂解液裂解红细胞)

问题:在脾脏细胞RNA提取过程中,加入等倍体积异丙醇离心后和75%乙醇离心后都有明显沉淀,但RNA浓度极低,只有5-20ng/μL,为啥呀?(叹气)

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4 个回答

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dxy_ziufs3xw

有帮助

请问最后怎么解决的呢?我最近也在做,提rna浓度在20-30😭

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科研小废物一枚user-title

最后没铺板子做了,直接提,或者你可以换那种大的细胞培养皿铺

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loveliufudan

有帮助

有以下几个可能的解释:

1. 细胞数量限制:提取的脾脏细胞数量可能较少,导致RNA的总量有限。如果您使用的是较小的细胞数(每个小鼠脾脏细胞数目较低),则相应的RNA浓度也会较低。

2. 细胞破碎和核酸蛋白复合物分离:在裂解液处理过程中,可能未能充分破碎细胞或完全分离核酸蛋白复合物,这可能导致RNA的部分损失或降解,从而降低提取的RNA浓度。

3. 沉淀和洗涤步骤问题:添加异丙醇和75%乙醇是为了沉淀和洗涤RNA。如果在沉淀和洗涤过程中未能充分沉淀和洗涤RNA,可能会导致RNA丢失或残留于上清中,从而降低RNA的浓度。

4. 逆转录反应问题:在逆转录过程中,如果逆转录酶的效率较低或反应条件不理想,可能会导致逆转录反应不完全,从而降低产生的cDNA数量,最终影响到测定的RNA浓度。


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sswei

有帮助

因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触致使组织中的 RNA 容易被降解,使RNA提取减少。

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毛利小五郎的徒弟

有帮助

提高脾脏细胞裂解时间吧,沉淀可能是破碎的细胞碎片,不一定含有RNA

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科研小废物一枚user-title

我的脾脏贴壁细胞特别难吹打下来,我加了trizol后静置了五分钟后,大概花两个小时吹打了六个六孔板(都是培养的原代脾脏细胞),大概百分之八十都有吹打下来,请问,会有可能是加了trizol这步裂解时间太长了吗?

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