小鼠脾脏取T细胞

小鼠脾脏取T细胞步骤:

1. 小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡5分钟，取出小鼠置于无菌操作台上，左腹侧朝上；

2. 在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；

3. 在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离下面的结缔组织，取出脾脏；放入盛有5ml 不完全培养液的培养皿中冲洗，剥去周围的结缔组织。

4.A、梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；

B、钢网研磨法：脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；

C、酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400 u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。

注意：1. 一般6-8周龄小鼠，根据品系不同，可得5-20×107细胞/只小鼠；2. 手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，用前取出器械，酒精灯上烧灼去除酒精，可保证无菌。

从单细胞悬液中分离淋巴细胞：

1. 另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。用1500转/分钟，20分钟。

2. 离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。

3. 洗好的细胞加入1640培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放37度孵育一小时。一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培养或做它用。但淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好用磁珠或流式分离。

使用组织研磨器或针头将脾脏碾碎成单细胞悬液。

将单细胞悬液通过离心等方式去除红细胞、血浆和血清等成分。

使用磁珠、细胞排序等技术分离T细胞。例如，可以使用特定抗体标记T细胞表面的CD4和CD8抗原，然后使用磁珠或细胞排序将这些T细胞分离出来。

检查提取到的细胞的纯度和活力，以确保它们适合后续的实验和应用。

需要注意的是，小鼠脾脏提取T细胞的具体步骤可能因实验目的和方法不同而略有区别。

1、分离小鼠淋巴结和脾脏

1、使用经机构批准的技术对所需数量的动物实施安乐死。使用C57BL/6雌性小鼠，年龄5-10周，因为与雄性或老年小鼠相比，它们具有较高的初始T细胞百分比和较低的体脂。

2、展开动物的四肢并将它们固定到位。从肛门到下巴纵向切割皮肤，同时注意不要刺穿更深的组织。

3、仔细切入腹膜取到脾脏。将组织放入收集盘中。

4、如果要收获更多组织，则重复该过程。此时，在冰上执行所有剩余步骤，直到分选后T细胞培养。

2、组织样本处理和CD4＋T富集

1、切记在培养皿中处理脾脏，以增加细胞。

2、从收集盘中取出组织并置于含有3ml PBS的新60mm培养皿中。使用无菌镊子将一块无菌尼龙网放在组织上。

3、取注射器（3-10毫升），用活塞另一侧，轻轻地磨组织，将组织磨碎。

4、上下吹打悬液几次，以打散剩余的一些细胞团块。在15毫升锥形管的开口处放置一块新的方形尼龙网，过滤悬液以除去残留的碎屑。

5、对于其它的脾组织重复步骤2-4。

6、一旦将悬液过滤到15ml管中，用PBS充满管的其余部分并倒置几次。在4℃下以475×g离心细胞5分钟。

7、对于脾细胞，在离心后吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于1ml冰冷的1X ACK溶液中1分钟以裂解红细胞。然后在ACK上加入10ml PBS，倒置试管，并在4℃下以475×g离心5分钟。

8、第7步离心脾细胞后吸出上清液，再悬浮于另外10ml PBS中。

10、现在开始CD4富集。如果不需要富集，可直接跳过这几步，进入分选准备步骤。

11、要使用CD4磁珠分选，通常将在85μlPBS中稀释的15μl磁珠用于标记1只小鼠的组织。根据需要增加磁珠混合物的体积，重悬沉淀，并在4℃下孵育15-30分钟。

12、用10ml PBS洗涤细胞，使悬液通过尼龙网进入新的15ml管中以除去碎片，并在4℃以475×g离心5分钟。

13、将沉淀用100μlPBS重悬，并在高速磁性细胞分选系统上进行阳性选择。如果使用手动分离系统，请按照制造商的说明进行浓缩。或者，将样品重悬于FACS缓冲液：含有1mM EDTA（pH = 8）和1％BSA的PBS中，无菌过滤。

14、取出阳性富集部分，再用10ml PBS洗涤。现在可以将富集的CD4级分标记用于分选。

进行小鼠脾脏T细胞的分离需要以下材料和试剂：

70%乙醇

1×PBS

无菌组织研磨器、组织培养皿、离心管等

人工合成的肽类酶、DNA酶等

Lympholyte M (无细胞葡聚糖)

1×红细胞溶解液

T细胞培养基

以下是一种常见的小鼠脾脏T细胞分离的方法：

将小鼠脾脏取出后，立即将其放入含有70%乙醇的无菌培养皿中，在紫外线灯下进行表面消毒。

将脾脏转移到一个新的无菌培养皿中，用1×PBS冲洗脾脏，然后用无菌剪刀和组织研磨器将脾脏细胞均质化。

将细胞悬液移至新的离心管中，加入红细胞溶解液进行红细胞溶解。

加入Lympholyte M并离心。分离出T细胞。

用T细胞培养基洗涤并培养T细胞。

需要注意的是，T细胞分离的成功率受到许多因素的影响，如操作的技巧、试剂的质量、实验条件等。因此，实验中应尽可能保持一致的操作方法，并在多个实验中进行重复来确保结果的准确性。