双荧光染色标记后细胞流式实验以及结果分析需要的注意事项?

每次试验均需设置以下三种对照：

（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物；

（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物；

（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

在细胞制备、培养阶段，如果该培养细胞是贴壁细胞，需用先用胰酶消化细胞，然后收集待测样品细胞，离心、洗涤、封闭后标记荧光素偶联抗体即可。

除研究对象外，其他条件均保持一致的对照实验组，用来确定染色特异性和实验结果的可靠性，如检测刺激后抗原表达量，以未刺激的样本做对照。

荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

调节电压时，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值，使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离；如果检测的目标细胞体积较大，可以适当降低电压值，使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外。

1. 在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工 序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练， 细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围 内，建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法，以保证实验的真实性和准 确性。

2. 建议送检细胞一定要足够量，一般要求 1×106 个细胞。不要过少。因为，如 细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细 胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。

3. 同一种细胞需同时做双标记时，须做双标记的同型对照，且两种抗体所标记 的荧光颜色务必不同。