用CD3CD28偶联磁珠刺激T细胞时包被beads的具体方法和步骤

以下是一种常用的方法和步骤来包被这种磁珠：

1. 准备所需材料：CD3 CD28偶联磁珠、细胞培养基、离心管、离心机、磁珠分离架、磁珠洗涤缓冲液。

2. 将CD3 CD28偶联磁珠取出，并在4℃下保存。

3. 将磁珠洗涤缓冲液加入离心管中，并将磁珠磁架放入离心管中。

4. 用离心机将磁珠洗涤缓冲液离心，去除上清液。

5. 重复步骤4，至少洗涤3次，以确保磁珠洗净。

6. 将细胞培养基加入离心管中，使磁珠悬浮在细胞培养基中。

7. 将细胞培养基中的磁珠与T细胞混合，使磁珠与T细胞充分接触。

8. 将磁珠和T细胞混合物放入离心管中，并将磁珠磁架放入离心管中。

9. 用离心机将磁珠和T细胞混合物离心，使磁珠与T细胞结合。

10. 倒掉上清液，保留磁珠和结合的T细胞。

11. 将细胞培养基加入离心管中，将磁珠和结合的T细胞悬浮在细胞培养基中。

12. 将磁珠和结合的T细胞混合物转移到培养皿或培养板中，进行后续实验。

实验步骤：

1. 抗体包被

用无菌PBS将anti-mouse CD3抗体（克隆号：145-2C11）稀释至5μg/ml，稀释后的抗体加入到24孔板中，每孔400μl，4°C包被过夜。（注：板子在加入抗体之前，先用无菌PBS润洗2-3遍，避免干孔）；

2. 小鼠脾脏淋巴细胞分离（次日）

（1）将70μm细胞筛网置于培养皿中，取小鼠脾脏放置于筛网中，加入5ml达优小鼠淋巴细胞分离液，对脾脏轻轻进行研磨（注：此步操作要快，避免分离液蒸发）；

（2）把悬有脾脏细胞的的分离液立即转移至15ml离心管中，随后在分离液上层轻轻覆盖500-1000μl的RPMI1640培养基（保持分离液与培养基分界明显）；

（3）室温，水平转子800g离心30分钟，设置离心机为缓升缓降；

（4）离心结束后吸出淋巴细胞层（白膜层），加入10ml RPMI1640洗涤一遍细胞，250g离心10分钟收集细胞；

（5）将上一步离心得到的细胞沉淀，重悬至扩增培养基中，并进行计数。

3. 细胞刺激（次日）

扩增培养基成分：RPMI1640 + 10%血清+ 5ug/ml anti-mouse CD28（clone：37.51） + 双抗

（1）将细胞浓度调整至1-2×10^6/ml（本次实验为2×10^6/ml，该浓度偏大）；

（2）从4°C冰箱取出前一天包被的板子，弃掉包被液，无菌PBS洗涤3遍；

（3）每孔加入500μl细胞悬液，放置于37°C含5% CO2细胞培养箱中培养。