悬浮细胞

免疫荧光详细步骤，到处都是，都是大同小异。
核心还在于自己多做，多练习，掌握每一步的核心原理，这样才能知其所以然的注意到细节，而不是机械的做。

对于悬浮细胞，关键难点在于固定。可以使用靶点科技的悬浮细胞免疫荧光专用玻片。

其实悬浮细胞不适宜做免疫荧光，建议诱导贴壁后再做

以下是悬浮细胞做免疫荧光的详细步骤：

细胞培养：将需要检测的悬浮细胞培养在含有所需培养基的组织培养皿中，以达到一定的密度。

细胞采集：将培养好的细胞离心，去除上清液，用PBS等缓冲液洗涤2-3次，使细胞悬浮于缓冲液中。

细胞固定：将细胞悬液滴加到预先准备好的载玻片上，使细胞附着在载玻片上。加入4%的乙醛或其他细胞固定剂，使细胞固定。

细胞透膜破裂：加入0.1%的Triton X-100或其他细胞透膜破裂剂，使细胞透膜破裂，释放内部蛋白。

阻断剂处理：将载玻片放入5%的BSA等阻断剂中，阻止非特异性的结合。

抗体孵育：加入特异性的一抗，使其与靶蛋白结合。孵育温度和时间可根据实验需要而定。

二抗荧光标记：加入标记有荧光物质的二抗，与一抗结合，形成荧光标记的复合物。

洗涤：用PBS等缓冲液洗涤3-4次，去除未结合的二抗。

荧光显微镜检测：将载玻片装置到荧光显微镜上，观察荧光信号，记录荧光图像。

注意事项：

所有步骤都要在无菌条件下进行，避免细菌等污染。

一抗和二抗需要进行特异性和交叉反应试验，确保检测结果的准确性。

孵育温度和时间、荧光标记物质、荧光信号的检测条件等需要根据实验需要进行优化。

步骤：

1. 使用PBS清洗细胞，并将细胞重新悬浮于PBS中(2-5 百万个/ml)

2. 把悬浮细胞专用免疫荧光玻片放置于12孔或者6孔细胞培养板孔里，直接滴加细胞于悬浮细胞专用免疫荧光玻片上(每个玻片上20-30万个细胞)

3. 使细胞附着30分钟，有些细胞需要延长附着时间，但不要超过1小时。使用约2ml PBS冲洗掉未结合细胞(切勿直接垂直滴加PBS到玻片上细胞，可将PBS滴加于板孔里侧边，然后轻轻摇晃3-5分钟)

4. 在显微镜下检查细胞附着情况，如果需要进一步培养，那么加入1ml培养基即可;若不培养即可直接固定，染色。